Федеральное государственное бюджетное учреждение науки

ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ им. Н.К. Кольцова РАН
Koltzov Institute of Developmental Biology of Russian Academy of Sciences

Лаборатория КЛЕТОЧНЫХ И МОЛЕКУЛЯРНЫХ ОСНОВ ГИСТОГЕНЕЗА

Направления исследований

Лаборатория клеточных и молекулярных основ гистогенеза традиционно занимается исследованиями механизмов клеточной дифференцировки и межклеточных взаимодействий, закономерностями формирования и функционирования тканевых систем в индивидуальном развитии. Особое внимание уделяется изучению стволовых клеток, поддерживающих физиологическую и репаративную регенерацию тканей и органов. Продолжая эти традиционные для лаборатории направления исследований, в настоящее время лаборатория планирует направить фокус исследований на изучение биологии кроветворных гемопоэтических клеток, механизмов дифференцировки клеток иммунной системы, регуляции процессов воспаления и регенерации тканей.

1. Гистогенез тканей внутренней среды: роль стволовых мезенхимных клеток. Стволовые мезенхимные клетки (МСК) в индивидуальном развитии.


Впервые проведено сравнительное исследование фенотипических особенностей и потенций к дифференцировке пре- и постнатальных генераций МСК (рис. 1). Полученные экспериментальные данные показали, что в ходе индивидуального развития происходит функциональное созревание МСК. На основании выявленных различий в свойствах МСК в зависимости от их локализации и стадии онтогенеза предложена концепция развития организуемой ими кроветворной ниши. В процессе развития МСК приобретают компетентность к дифференцировке в специфические клеточные компоненты ниши, вследствие чего меняется качество кроветворного микроокружения (рис. 2). Это приводит к формированию популяции дефинитивных стволовых кроветворных клеток, способствуя их переходу от активного размножения в печени зародыша к состоянию покоя и самоподдержания в зрелом костном мозге.

В лаборатории проводятся также исследования спонтанного миогенеза в немышечных органах, которые показали присутствие предшественников скелетно-мышечной дифференцировки в пренатальном развитии в печени, селезенке, кишечнике, тимусе.


Рис. 1. Источники и функции мезенхимных стромальных клеток


Рис. 2. Мезенхимные стромальные клетки и развитие кроветворной ниши в онтогенезе

Рис. 3. CD90 в МСК из печени 14-суточных зародышей крысы


Рис. 4. Эпителиальная колония в первичной культуре клеток зародышевой печени крысы. Иммуноцитохимическое окрашивание на панцитокератин



Рис. 5. Дифференцировка МСК костного мозга крысы в индукционных средах:

а – остеогенез, б – адипогенез


Рис. 6. Хондрогенез в эктопическом трансплантате печени 16-суточного зародыша крысы

Рис. 7. Спонтанный миогенез в культуре зародышевой печени крысы:

а – окрашивание азур-эозином,

б – иммуноцитохимическое окрашивание на Myf-5


Не исключено, что существование миогенных предшественников в неорганотипической локаликации возможно благодаря МСК, которые создают для них соответствующее микроокружение. Исследована способность МСК участвовать миогенезе и показано, что МСК в условиях in vitro усиливают миогенную активность мышечных клеток посредством паракринного влияния, обладая, однако, слабыми миогенными потенциями и способностью участвовать в формировании миотуб путем слияния.

В настоящее время начаты исследования участия МСК в регенерации на моделях восстановления мышечной ткани после повреждения. Уникальные свойства МСК (способность к регуляции многих клеточных функций путем паракринного влияния) и их способность участвовать в регуляции репаративного процесса на всех его стадиях – воспаления, пролиферации и ремоделирования позволяют рассматривать их как инструмент тканевой инженерии in vivo, стимулирующий регенерацию тканей за счет внутренних резервов. В этой связи весьма перспективны исследования участия МСК в регенерации на разнообразных экспериментальных моделях, активации их паракринной функции и повышения эффективности доставки МСК и кондиционированной ими среды в область повреждения.


2. Прямые межклеточные взаимодействия в онтогенезе (В.Я. Бродский)


Под руководством профессора В.Я. Бродского в совместных работах с группой эмбриофизиологии (лаб. проблем регенерации) выявлен механизм прямых межклеточных взаимодействий. В исследованиях клеточных культур и in vivo в экспериментах на крысах определены сигнальные факторы и цепь процессов в цитоплазме, приводящих к кооперации клеток в ритмах разных функций. Обнаружены нарушения кооперации клеток соответственно с изменениями межклеточной среды при старении и получены первые данные о возможности компенсации изменений.

На оригинальной модели на примерах кинетики синтеза белка в печени и в популяции кератиноцитов кожи в опытах in vitro и in vivo показана значимость прямых межклеточных взаимодействий в регуляции активности органа. Впервые выявлены сигнальные факторы кооперации клеток как положительные, организующие активность клеток, так и отрицательные, дезорганизующие клеточную популяцию; среди них катехоламины – серотонин, норадреналин, дофамин, их фармакологические производные, а также мелатонин и ганглиозиды. В качестве ключевого фактора организации клеточных популяций рассматривается фосфорилирование белков, что объясняет некоторые стороны действия используемых в клинике мелатонина, фенилэфрина, дофамина и открывает перспективу поиска лекарств-организаторов.



3. Дифференцировка макрофагоподобных клеток из индуцированных плюрипотентных предшественников (И.В. Лядова, Т.А. Ненашева, Я.В. Сердюк)


Макрофаги играют существенную роль в развитии и регуляции иммунного ответа, защите организма хозяина от патогенов, репаративных процессах, поддержании гомеостаза. Нарушение функционирования макрофагов является патогенетическим фактором развития многих заболеваний, включая инфекционные, онкологические, сердечно-сосудистые, наследственные и другие. Это определяет важность изучения биологии макрофагов и потенциальную возможность применения данных клеток в качестве клеточной терапии ряда заболеваний. Во взрослом организме основной пул макрофагов представлен клетками, локализованными в тканях («резидентные макрофаги тканей» «tissue-resident macrophages»), которые берут свое начало от клеток желточного мешка и эмбриональной печени. При этом основным источником макрофагальных клеток человека, используемым в исследовательских целях, являются моноциты периферической крови, которые по многим характеристикам отличаются от резидентных макрофагов тканей. В связи с этим важной задачей является разработка новых методов получения макрофагов человека. Сотрудники лаборатории проводят исследования по получению макрофагов человека из индуцированных плюрипотентных стромальных клеток (иПСК). Разрабатываемая модель генерации макрофагальных клеток будет использована для изучения механизмов регуляции и разработки методов коррекции воспалительного и антибактериального ответа макрофагов.


Работа поддержана грантом РНФ № 19-75-20176 «Клеточная модель получения фагоцитов человека».



Рис. 8.
А – моноцитоподобные клетки (МПК), 40 день дифференцировки, световая микроскопия,
Б – МПК, 26 день дифференцировки, цитоспин
В – макрофагоподобные клетки, 7 день дополнительной дифференцировки в M-CSF.



4. Изучение влияния экзосом мезенхимальных стромальных клеток на регенерацию скелетных мышц (Н.Н. Буторина, А.Н. Новокрещенова)



В последние годы стало известно, что мезенхимальные стромальные клетки (МСК) способствуют регенерации тканей главным образом не за счет дифференцировки и замещения поврежденных клеток, но за счет паракринного влияния, в том числе с помощью секретируемых внеклеточных везикул и экзосом. В лаборатории исследуются экзосомы, выделяемые МСК из разных источников, их свойства и влияние на регенеративные процессы. Экзосомы способны переносить в окружающую среду белки, липиды и нуклеиновые кислоты и регулировать многие клеточные процессы, среди которых воспалительный ответ и пролиферация клеток. Были исследованы образцы экзосом МСК из четырех тканевых источников – жировой ткани, костного мозга, интактных и скелетных мышц – и проведен сравнительный анализ их состава и влияния на регенерацию мышц. Было подтверждено, что экзосомы в выделенных образцах имеют соответствующие имеющимся литературным данным размеры частиц и содержат поверхностные экзосомальные маркеры CD9 и CD63. В образцах экзосом выявляли три вида промиогенных микроРНК, и все три вида присутствовали в экзосомах костномозговых МСК, и один из них – в экзосомах МСК поврежденных мышц. В других образцах исследованные микроРНК отсутствовали. На модели фиброза in vitro показано, что под действием экзосом значительно снижается количество и размер фиброзных узелков, а на модели миогенеза было показано, что количество миотуб, образующихся в культуре под действием экзосом, значительно выше, по сравнению с контролем. Таким образом, выявлено антифибротическое и промиогенное действие экзосом. Наиболее эффективными в обоих опытах in vitro оказались экзосомы от МСК интактных мышц.

Также был проведен сравнительный анализ действия МСК и экзосом in vivo на модели разреза икроножной мышцы крыс. В результате морфологического исследования было выявлено, что экзосомы не оказывают столь же выраженного стимулирующего действия на рост мышечных волокон и кровеносных сосудов, как МСК, но вызывают значительно меньшее по интенсивности воспаление после введения в ткань, благодаря чему весь процесс заживления ткани протекает более благоприятно.



Рис. 9. Влияние экзосом на регенерацию скелетных мышц



Рис. 10. Паракринные свойства МСК [Kong et al., 2017].