Федеральное государственное бюджетное учреждение науки ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ им. Н.К. Кольцова РАН Koltzov Institute of Developmental Biology of Russian Academy of Sciences
В 1992 г. в лабораторию гистогенеза, возглавляемую академиком Н.Г. Хрущовым, перешла группа специалистов из Научно-производственного центра медицинской биотехнологии Минздрава СССР, а в 1995 г. коллектив получил статус лаборатории,
которую назвали "Лаборатория проблем клеточной пролиферации".
По истечении 20 лет, в 2016 году было принято решение сменить название на новое – "Лаборатория клеточной биологии".
Первоначально лабораторией руководил ее основатель – д.б.н., профессор В.В. Терских, затем – д.б.н., чл.-корр. РАН, А.В. Васильев, а в настоящее время ее возглавляет д.б.н., чл.-корр. РАН, Е.А. Воротеляк.
Основной темой исследований лаборатории на протяжении нескольких десятков лет была и остается биология кожи. Мы занимаемся изучением процессов дифференцировки и морфогенеза эпидермиса, разрабатываем новые способы культивирования клеток кожи, исследуем эпителио-мезенхимные взаимодействия в коже in vivo и в моделях in vitro. В частности, мы выращиваем в культуре полноценный эквивалент кожи человека и эпидермиса, который воспроизводит все закономерности пролиферации, дифференцировки и стратификации кератиноцитов (Рис. 1). Такие эквиваленты используется для исследований в области клеточной дифференцировки, наследственных заболеваний кожи, фармакологии и косметологии. С использованием этой модели были охарактеризованы полученные нашим коллективом клеточные линии от пациентов с дистрофическим буллезным эпидермолизом (Beilin et al., 2021), что позволит в будущем тестировать разрабатываемые методы коррекции симптомов этого тяжелого заболевания.
Рис. 1. Эквивалент эпидермиса человека, выращенный in vitro (окраска гематоксилин – эозин).
В лаборатории был проведен ряд исследований в области изучения волосяного фолликула. Волосяной фолликул является удивительным миниорганом, который на протяжении всей жизни организма способен непрерывно регенерировать. Такая высокая регенеративная способность волосяного фолликула обеспечивается наличием в его составе нескольких пулов стволовых клеток. Мы изучаем поведение стволовых клеток фолликула в различных условиях (в норме, в ответ на повреждение, при культивировании), механизмы морфогенеза, регенерации и эпителио-мезенхимных взаимодействий в процессе формирования волосяного фолликула. Мы исследуем развитие фолликула в онтогенезе и определяем факторы, влияющие на него (Рис. 2).
Мы получаем и культивируем клетки волосяного фолликула мыши и человека для разработки подходов к воспроизведению морфогенеза волосяного фолликула. Создание технологии выращивания фолликулоподобных структур в культуре имеет большие перспективы в регенеративной медицине для лечения облысения (алопеции). Подбирая условия формирования трехмерных структур в культуре мы, с одной стороны, можем проследить за начальными стадиями морфогенеза волосяного фолликула in vivo, а с другой стороны, создать биотехнологический продукт для регенерации придатков кожи. В рамках проекта РНФ№16-14-00204 мы создали зачатки волосяного фолликула из клеток взрослой кожи: клеток дермальной папиллы, меченой красным флуоресцентным белком, и неокрашенных кератиноцитов (Рис. 3). Впервые выявлена и показана важнейшая роль гиалуронового матрикса в регуляции и поддержании процессов развития волосяного фолликула (Kalabusheva et al, 2017).
Рис. 2. Срез кожи эмбриона мыши на стадии Е18,5, окраска антителами против P-кадгерина (зеленый) и инволюкрина (красный). Ядра докрашены DAPI (синий).
Рис. 3. Зачаток волосяного фолликула in vitro. Клетки дермальной папиллы меченные RFP (красные) и кератиноциты окрашенные антителами к кератину-6 (зеленое окрашивание)образуют трехмерную структуру, ядра покрашены DAPI (синий).
Также у нас есть методы позволяющие получать клетки кожи из плюрипотентных стволовых клеток человека. Полученные клетки способны формировать полноценные волосяные фолликулы после трансплантации иммунодефицитным животным (Gnedeva et al., 2015).
Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки
Мы активно получаем линии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) и работаем с ними и их дериватами (Риc. 4). Нами было получено множество оригинальных линий ИПСК при помощи репрограммирования из различных соматических клеток, в т.ч. от доноров-носителей наследственных заболеваний (Dashinimaev E.B. et al., 2017; Konovalova E.V. etal., 2015). ИПСК человека, помимо потенциальной возможности их использования в регенеративной медицине и фундаментальных исследованиях плюрипотентности и клеточной дифференцировки, можно использовать для моделирования наследственных заболеваний in vitro. В частности, при помощи метода направленной дифференцировки мы получили культуры нейронов от пациентов с синдромом Дауна (Риc. 5), и на этой модели показали признаки патологического метаболизма бета-амилоида, по сравнению с контрольными культурами клеток (с нормальным кариотипом).
Для получения трансгенных клеточных линий мы используем все современные методы лентивирусной трансдукции и транспозонной системы SleepingBeauty. Коллектив обладает определенным уровнем экспертизы в области использования CRISPR-опосредованных систем трансактивации в целях репрограммирования клеток человека.
Рис. 4. Колония идуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК).
Рис. 5. Дифференцировка ИПС клеток в нейральном направлении. Самоорганизация клеток в т.н. "розетки", состоящие из нейральных стволовых клеток. Окраска на Nestin (зеленым), ядра покрашены DAPI (синий).
Тканевая инженерия
У наших сотрудников накоплен многолетний опыт работы с разными типами стволовых и прогениторных клеток человека: фибробластами кожи, кератиноцитами, клетками дермальной папиллы, мезенхимными стволовыми клетками костного мозга и жировой ткани, культурами нейронов и клеток эндотелия, первичными половыми клетками, эмбриональными стволовыми клетками и ИПСК. Используя наш опыт и опыт наших коллег, действующих клиницистов был разработан комплекс методов для нового направления медицинской науки – регенеративной медицины.
Наш коллектив имеет многолетний опыт изготовления живого эквивалента кожи (ЖЭК), содержащего мезенхимальные и эпителиальные клетки, и его применения в исследованиях по ранозаживлению у мышей и крыс на специально разработанных моделях острой и длительно незаживающей раны (Воротеляк и др. 2017). Моделирование ран на животных активно применяется нами в исследованиях стимуляции ранозажиления и эффективности трехмерных органотипических конструкций – эквивалентов кожи (Chermnykh et al, 2018, Моргун и др. 2018). К настоящему времени уже показали свою эффективность такие разработки, как дермальный эквивалент, эквивалент роговицы, эквивалент уретры и др., круг интересов сотрудников лаборатории в этой области расширяется. Есть разработки подходов к восстановлению хрящевой ткани, лечению диабета и генно-клеточной терапии. Нами разработан эквивалент хрящевой ткани из постнатальных хондроцитов без использования подложки для клеток (Риc. 6). При трансплантации в дефект хрящевой ткани уха кролика хрящевой эквивалент встраивается в структуру поврежденной ткани и восполняет дефект. В работе проводимой совместно с НИИ глазных болезней им. Гельмгольца показано, что трансплантация хрящевого эквивалента в ожоговое бельмо позволяет получить роговично-хрящевой комплекс большей толщины по сравнению с ожоговыми бельмами в контроле, что может создать хорошие условия для последующей фиксации опорной пластины кератопротеза и позволит предотвратить ее обнажение (Риc. 7).
В лаборатории мы также исследуем роль мультипотентных стромальных клеток в развитии различных патологических процессов, таких как развитие опухоли и метастазирование, мышечная дистрофия Ландузи-Дежерина. Для моделирования клеточных взаимодействий в процессе развития лице-лопаточно-плечевой мышечной дистрофии используются миобласты от больных и здоровых доноров и МСК. В работе с коллегами из НГУ им. Н.И. Лобачевского и Нижегородской государственной медицинской академии используя методы прижизненного биоимиджинга показано, что системное введение МСК тормозит образование метастазов аденокарциномы молочной железы (Meleshina, 2015)
Рис. 6. Внешний вид хрящевого эквивалента
Рис. 7. Трансплантация хрящевого эквивалента в ожоговое бельмо (120 суток после трансплантации)
Экспериментальная эмбриология
В 2018 году в лаборатории было запущено новое направление: экспериментальная эмбриология. В рамках этого направления ведется работа по разработке тканевого эквивалента эндометрия мыши (внутреннего слоя матки) и изучение взаимодействия эмбриона мыши с клетками эпителия и стромы эндометрия при имплантации эмбриона. Это сложный процесс, обусловленный молекулярными и физическими взаимодействиями эмбриона и эндометрия. Правильное прохождение имплантации и раннего постимплантационного развития необходимо для успеха последующей беременности. Результаты, полученные, при изучении имплантации с использованием мышиной модели могут улучшить наше понимание того, как этот процесс проходит у человека.
Грант РНФ 21-74-30015 на 2021-2024 гг.
В 2021 году лаборатория выиграла грант РНФ по мероприятию «Проведение исследований научными лабораториями мирового уровня в рамках реализации приоритетов научно-технологического развития Российской Федерации» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными. Название проекта «Моделирование эпителиально-мезенхимных взаимодействий в нормальной, патологической, генетически модифицированной клеточной нише с целью стимуляции эпиморфной регенерации эпителиальных тканей». Руководитель проекта д.б.н., чл.-корр. РАН Воротеляк Екатерина Андреевна.
Основная проблема, на решение которой направлено выполнение проекта – идентификация высокоэффективных клеточных резервов взрослого организма для стимуляции регенерации тканей, которая бы сопровождалась восстановлением функциональной состоятельности эпителио-стромальных органов и тканевых систем, что обеспечивает снижение или устранение потребностей в длительной реабилитации или медикаментозной и другой компенсации функций этих органов.
Целью первого года работы была характеристика стромальных и эпителиальных клеток трех выбранных в качестве объекта органов – кожи, легкого и эндометрия. Нашей задачей был подбор маркеров, характеризующих, с одной стороны, принадлежность к строме, а с другой – позволяющих выделить в ней субпопуляции клеток с отличающимися фенотипом и функциями.
Был исследован паттерн экспрессии специализированных маркеров в коже мыши и человека, а так же в эквивалентах и органоидах полученных из клеток из кожи. Показали, что из первоначально-гомогенной популяции клеток обособились CD26+/CD26- и PDGFRα+/ PDGFRα- субпопуляции фибробластов. CD26-положительные клетки, выявленные в модели органоидов, соответствуют фибробластам папиллярной дермы, PDGFRα-негативные клетки, выявленные в монослойной культуре и дермальных эквивалентах, фибробластам ретикулярной дермы. Показана зависимость возникновения данных субпопуляций в коже мыши от срока эмбрионального развития. В модели органоидов выявлена популяция CD26+FAP+PDGFRα- фибробластов, обладающих способностью к индукции экспрессии YAP и активации YAP-сигналинга.
Так же были обнаружены различающиеся популяции стромальных клеток в тканях легкого мыши. Перибронхиолярные и периваскулярные гладкомышечные клетки экспрессируют SM22α, располагаются вокруг сосудов и респираторного эпителия. Перибронхиолярные гладкомышечные клетки и интерстициальные фибробласты экспрессируют PDGFRα. Некоторые субпопуляции интерстициальных фибробластов легких и перициты экспрессируют PDGFRβ. На срезах легкого показали локализацию PDGFRα+ SM22α+ перибронхиолярных гладкомышечных клеток, SM22α+ периваскулярных гладкомышечных клеток и PDGFRβ+ перицитов. Данные экспрессии Yap1, Taz (Wwtr1) и нижестоящих мишеней Ccn1 и Ccn2 в тотальной фракции мезенхимных клеток CD45-CD31-CD326- косвенно указывают на более выраженную активность сигналинга в мезенхиме мышат Р7.
Были определены основные периоды развития эндометрия мыши. Геторогенность стромальных клеток в паттерне окраски CD90 и CD146 была выявлена и в тканях матки мыши, мы предполагаем, что это популяция стволовых клеток. Причем размер стволовой популяции изменяется в ходе эстрального цикла с максимумом в раннем эструсе. Обнаружена зависимость в уровнях экспрессии генов: Yap (YAP), Wwtr1 (TAZ) и Ccn1, кодирующих белки, участвующие в сигнальном пути YAP.
В результате выполнения проекта мы планируем не только охарактеризовать морфогенетически активные клеточные элементы, поддерживающе эпиморфную регенерацию эпителия, определить сигнальные пути, обеспечивающие регенерацию тканей с восстановлением функциональности эпителиев, а также создать методическую платформу по моделированию эпителио-мезенхимных взаимодействий в норме и при патологии.
Проект соответствует направлению «Н3. Переход к персонализированной медицине, высокотехнологичному здравоохранению и технологиям здоровьесбережения, в том числе за счет рационального применения лекарственных препаратов (прежде всего антибактериальных)» Стратегии НТР РФ.
Рис. 8. Органоиды легких мыши, 10 день культивирования (фазовый контраст).
Рис. 9. Оптический срез органоида легкого мыши, иммунофлуоресцентное выявление Е-кадгерина (красное окрашивание) и виментина (зеленое окрашивание), ядра покрашены DAPI (синий).
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки
Рис. 3. Зачаток волосяного фолликула in vitro. Клетки дермальной папиллы меченные RFP (красные) и кератиноциты окрашенные антителами к кератину-6 (зеленое окрашивание)образуют трехмерную структуру, ядра покрашены DAPI (синий).
