«Использование генетических технологий для поиска биомаркеров, моделирования и терапии заболеваний человека» в рамках Федеральной научно-технической программы развития генетических технологий 2019-2027 годы,
федерального проекта
«Развитие масштабных научных и научно-технических проектов по приоритетным исследовательским направлениям» национального проекта
«Наука и университеты»

Общая информация о проекте

Цель:

Основные задачи

• Создание in vitro моделей заболеваний человека – болезни Паркинсона, спиноцеребеллярных атаксий 1 и 17, идиопатического легочного фиброза, заболеваний костной ткани;
• Выявление роли ряда мутации в патогенезе ряда заболеваний человека (нейродегенеративные, легочные, костной ткани);
• Разработка технологии изменения трехмерной организации генома с помощью белка dCas9-CTCF с целью коррекции экспрессии генов;
• Получение генетически модифицированных макрофагов человека;
• Разработка новых систем доставки в клетку терапевтических генно-инженерных конструкций на основе прокариотных векторов, участвующих в горизонтальном переносе генов;
• Исследование и применение неканонических функций гена Oct4;
• Изучение клеточных и молекулярных детерминант изменений работы мозга при социально-значимых патологиях и физиологических состояниях при помощи секвенирования РНК одиночных клеток и многоступенчатом биоинформатическом анализе данных;
• Разработка биомедицинского клеточного продукта (БМКП), предназначенного для лечения инфекционных заболеваний легких на основе геномодифицированных клеток, секретирующих антимикробный пептид SE-33. Обоснование эффективности БМКП на разработанных схожих моделях лабораторных животных;
• Разработка БМКП или лекарственного средства (ЛС) на основе геномодифицированных клеток, продуцирующих GLP-1 для коррекции симптомов сахарного диабета;
• Проведение доклинических исследований БМКП/ЛС, разработка проекта промышленного регламента, спецификации и других документов в составе досье;
• и другие.

Исполнитель

ФГБУН Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (ИБР РАН)

Соисполнители

• ФГБУН Институт цитологии РАН (ИНЦ РАН);
• ФГБОУ ВО «Приволжский Исследовательский Медицинский Университет» Минздрава России (ПИМУ);
• ООО «АКРУС БИОМЕД»;
• ООО «БИОХАРТ»;
• ООО «Покровский Банк Стволовых Клеток» (ПБСК)

Финансирование

Ожидаемые ключевые результаты

• Разработаны инновационные системы модификации геномов (ИБР РАН) – новый инструмент для коррекции трехмерной организации генома (белок dCas9-CTCF). Изучено влияния реконструкции границ TAD на уровень экспрессии генов, участвующих в прогрессии меланомы.
• Осуществлено моделирование и генетическая коррекция патологических состояний с использованием культур клеток, в том числе для тестирования лекарственных препаратов и перспективных лечебных молекул (ИБР РАН, ИНЦ РАН и ООО «ПБСК») – болезнь Паркинсона (БП), спиноцеребеллярные атаксии 1 и 17 типов, идиопатический легочный фиброз, остеопороз, остеодистрофия.
• Выявлены генетические мишени ряда патологий человека (ИБР РАН, ИНЦ РАН и ООО «ПБСК») – болезнь Паркинсона (LRRK2), онкологические заболевания, идиопатический легочный фиброз (компоненты Notch), патологии костной ткани (гены семейства GPCR). Исследованы регулоны, задействованные в модификации работы мозга при сахарном диабете 1-го и 2-го типа (и при его компенсации при терапии GLP-1), хроническом стрессе, тревожности и нейродегенерации.
• Разработаны генетические конструкции и эффективные системы генетического редактирования, системы доставки для решения задач геномного редактирования, модифицированные линии лабораторных животных и клеток, в том числе клеток иммунной системы (ИБР РАН, ИНЦ РАН и ООО «ПБСК») – Выявлены потенциальные сайты рекомбинации бактериофагов (AttP) для разработки систем таргетной доставки и конструирования новых векторов на основе бактериофагов. На основе систем редактирования генома получены геномодифицированные макрофаги человека, клеточные и мышиные модели для оценки влияния локуса Oct4 на соседствующие гены MHC-кластера. Получены трансгенные мыши, репортерные по экспрессии Oct4.
• Разработка (ДКИ) биомедицинского клеточного продукта (БМКП) для лечения инфекционных заболеваний легких на основе генно-модифицированных клеток, секретирующих антимикробный пептид SE-33 (ИБР РАН, ООО «БиоХарт», ООО «Акрус Биомед»).
• Разработка (ДКИ) БМКП или лекарственного средства (ЛС) на основе генномодифицированных клеток, продуцирующих GLP-1 для коррекции симптомов сахарного диабета (ИБР РАН, ООО «БиоХарт», ООО «Акрус Биомед» ).
• Новая лаборатория биоинформатики и молекулярной генетики (ИБР РАН)
• Новые ЦКП (2) – биологических моделей и геномных технологий (ИБР РАН).
• Новая межлабораторная группа биоинформатического анализа (ИНЦ РАН).
• Образовательные программы: «Генетические основы патологических изменений в клетке» (ИНЦ) и «Генная и клеточная инженерия для биомедицины» (ИБР, ПИМУ).
• Образовательный курс «Генетические основы патологических процессов в клетке» (ИНЦ).
• Стажировки ученых до 39 лет в ИЦиГ РАН (Россия), ФНКЦ ФХМ ФМБА (Россия), Венском Медицинском Университете (Австрия), Центре исследований биологической сигнализации (Германия), Институте канцерогенеза Густава Руссо (Франция), Каролинском институте (Швеция).
• Конференции для молодых ученых: «Генетические технологии в биологии развития и биомедицине» в рамках XIX международной школы по биологии развития (ИБР РАН), конференция молодых ученых (ИНЦ РАН), международная конференция «Геномный анализ и генетическая модификация клеток» (ИНЦ РАН).

Достижение целевых показателей

Результаты 1-го этапа выполнения проекта

На первом этапе работы получен ряд фундаментальных знаний об организации генома, особенностях плюрипотентного состояния, вопросах клеточного репрограммирования и дифференцировки, связи патологической внутриклеточной сигнализации с генетическими дефектами и нарушений в экспрессии генов, так и на решение прикладных задач генетической и фармакологической коррекции состояний, связанных с рядом социально-значимых заболеваний, включая нейродегенеративные и онкологические патологии, идиопатический легочный фиброз и патологии костной ткани. В частности, получены следующие результаты: (1) созданы пациент-специфичные клеточные модели спиноцеребеллярных атаксий 1 и 17 типов; (2) получены линии базальных клеток легкого человека из биоптатов бронхов с целью разработки адекватных клеточных моделей для прогностического исследования перспективных лечебных молекул; (3) проведена индукция остео-дифференцировки в ИПСК, полученных из фибробластов здоровых доноров; (4) сформированы базы данных последовательностей тРНК человека и мыши; (5) проведен биоинформатический анализ баз данных и получение сведений о влиянии полиплоидии на сигнальные каскады, метаболические пути и транскриптом стволовых, дифференцированных и опухолевых клеток с целью создания прогностического аппарата для поиска новых геннотерапевтических мишеней; (6) проведен анализ готовой коллекции профилей изолированных кардиомиоцитов, полученных от взрослых крыс, перенесших системный воспалительный стресс в неонатальном возрасте и от контрольных животных с целью создания прогностического аппарата для поиска новых геннотерапевтических мишеней (7) проведены эксперименты по электрофизиологической регистрации кальциевых токов на клеточных моделях спиноцеребеллярных атаксий 1 и 17 типов; (8) охарактеризованы линии базальных клеток легкого человека, полученных из биоптатов бронхов с целью разработки адекватных клеточных моделей для прогностического исследования перспективных лечебных молекул; (9) получены клеточные линии для оценки вклада промоторной последовательности гена Oct4 в цис-регуляцию окружающих генов MHC-кластера; (10) проведен анализ общедоступных баз данных и выявление потенциальных сайтов рекомбинации бактериофагов (AttP) в геномах человека и мыши для разработки систем таргетной доставки; (11) проведен биоинформатический анализ транскриптомов различных популяций клеток аденокарциномы легкого; (12) разработан лабораторный регламент получения геномодифицированных клеток, способных экспрессировать противомикробный пептид SE 33, а также инкретин GLP-1; (13) разработаны методы доставки в клетки генетических конструкций, для редактирования геномов клеток с целью получения стабильной экспрессии противомикробного пептида SE 33 и инкретина GLP-1; (14) произведена наработка генетических конструкций и клеточных линий для работ на втором этапе; (15) получены клеточные линии K562 с делецией сайтов связывания CTCF, вовлеченных в формирование сложных петлевых рисунков; (16) получены карты пространственных взаимодействий для клеток линий с делецией сайта связывания CTCF, с привлечением dCas9-CTCF-GFP и контрольной линии; (17) получены первые данные по секвенированию одиночных клеток миндалевидного тела - региона мозга, ответственного за обучение страху. На основе почти 4000 клеток предложена классификация и идентифицированы основные клеточные типы. Подготовлена экспериментально-протокольная база для дальнейших экспериментов (18) обобщены данные литературных источников по темам проекта и сделаны некоторые другие работы.

Все работы этапа выполнены полностью. В целом, полученные результаты создают задел для выполнения целей проекта. Результаты этого проекта будут существенно способствовать пониманию механизмов развития заболеваний человека и помогут определить конкретные молекулярные детерминанты и мишени. Согласно дальнейшему плану экспериментальных работ на следующих этапах часть данных будет переведена в медицинский путём внедрения оценки роли экспрессии генов, специфичных для определенного типа клеток, и сетей регуляции генов в различных заболеваниях, что в дальнейшем может быть использовано в разработке новых терапевтических подходов на основе персональной медицины.

На данном этапе работы по развитию кадрового потенциала были сосредоточены на разработке образовательной программы, в рамках реализации которой на следующих этапах работы планируется проводить обучение кадров.

Образовательная программа дополнительного профессионального образования «Генная и клеточная инженерия для биомедицины» со сроком освоения 72 академических часа (далее – Программа) разработана и будет реализована в ФГБОУ ВО «ПИМУ» Минздрава России (далее – Университет). Программа разработана на основе следующих документов:

1) Федеральный закон "Об образовании в Российской Федерации" от 29.12.2012 N 273-ФЗ;

2) Единый квалификационный справочник должностей руководителей, специалистов и служащих, раздел «Квалификационные характеристики должностей работников в сфере здравоохранения», утверждённый приказом Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 23 июля 2010 г № 541н.

Программа реализуется на основании лицензии Федеральной службы по надзору в сфере образования и науки на осуществление образовательной деятельности от 07 мая 2018 г. № 2739.

Программа состоит из двух модулей: «Генная инженерия» и «Клеточная инженерия». Предполагается изучение таких тем как «Молекулярные основы наследственности», «Основы технологии рекомбинантных ДНК», «Основы клеточной инженерии», «Доклинические и клинические исследования биомедицинских клеточных продуктов».

В основу Программы положены принципы мультидисциплинарности, доказательности и системного подхода. Программа ориентирована на лиц с высшим и средним профессиональным образованием, меняющих условия профессиональной деятельности и социальной среды, совершенствующих имеющиеся профессиональные компетенции, необходимые для профессиональной деятельности и повышения профессионального уровня в рамках имеющейся квалификации.

Основным результатом, который будет достигнут слушателем в результате освоения программы, является способность к выполнению фундаментальных и прикладных научных исследований и разработок в области генной и клеточной инженерии, а также проведению доклинических и клинических исследований биомедицинских клеточных продуктов. Освоение Программы и получение новых компетенций в области генной и клеточной инженерии позволит специалистам биомедицинского направления разрабатывать новые методы, подходы и технологии, биомедицинские клеточные продукты для терапии различных заболеваний человека, регенеративной медицины.

В ходе реализации проекта на первом этапе на базе ФГБУН Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (далее – ИБР РАН) организованы два Центра коллективного пользования (далее – ЦКП).

ЦКП группы геномных технологий создан для разработки новых методов и технологий генетической модификации и проведения робот по модификации геномов клеток с целью создания геномодифицированных культур клеток и линий животных. Основными направлением деятельности ЦКП «Группа геномных технологий» является обеспечение подразделений ИБР РАН, а также научно-исследовательских, образовательных, клинических и экспертных организаций Российской Федерации векторами и вирусами для модификации генома клеток, а также геномодифицированными клетками, тканями и животными. Целями ЦКП «Группа геномных технологий» являются: (1) создание в ИБР РАН инфраструктуры, позволяющей проводить генетические манипуляции на мировом уровне; (2) разработка и наработка средств для модификации генома (векторные и вирусные конструкции) и продуктов на их основе (клеточные линии, ткани и животные). Задачами ЦКП «Группа геномных технологий» являются: (1) разработка дизайна векторных и вирусных конструкций, а также разработка новых подходов для генетической модификации клеток и животных; (2) наработка векторных и вирусных конструкций, позволяющих проводить генетические модификации клеток, тканей и животных; (3) создание коллекции средств для модификации генома (векторные и вирусные конструкции); (4) наработка линий клеток-продуцентов векторных и вирусных конструкций, а также создание в ИБР РАН коллекции данных клеток; (5) наработка линий геномодифицированных клеток, а также создание в ИБР РАН коллекции данных клеток; (6) наработка геномодифицированных тканей, а также создание коллекции данных тканей; (7) создание и выращивание геномодифицированных животных; (8) создание коллекции геномодифицированных клеточных линий и тканей; (9) практическая и научная связь с другими филиалами подразделениями ИБР РАН и лабораториями других учреждений; (10) выполнение прикладных и теоретических исследований для обеспечения научной, производственной, образовательной, диагностической работы, как ИБР РАН, так и иных учреждений; (11) разработка, совершенствование и утверждение нормативной документации по вопросам порядка учета, характеристики, хранения и передачи, разрабатываемых ЦКП продуктов, другим учреждениям; (12) обеспечение различных научных и медицинских организаций Российской Федерации разрабатываемыми ЦКП продуктами, полностью соответствующими заявленным свойствам.

ЦКП группы биологических моделей создан для обеспечения работ по созданию и содержанию модельных лабораторных животных в соответствии с принятыми нормами GLP, создания условий для содержания и разведения животных SPF-статуса, разработки протоколов для возможности обмена генетическими линиями животных с зарубежными центрами генетических ресурсов, а также работы по освобождению от видоспецифических патогенов (редеривации) уникальных генетических линий лабораторных животных, что расширит возможности прямой экспериментальной проверки новых теоретических идей и прикладных разработок в области фундаментальной биологии, биомедицины, фармакологии.

Для организации ЦКП был проведен ремонт помещений, закупка оборудования и ряд организационно-штатных мероприятий.