Основные направления исследований

Группа, а затем Лаборатория исследования геномных повторов эукариот под руководством А.И. Калмыковой, была создана в 2005 г. в Институте молекулярной генетики РАН после получения гранта по программе Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология - Новые группы». В 2018 г. А.И. Калмыкова была удостоена премии имени Н.К. Кольцова за цикл работ «Роль коротких РНК в защите целостности генома и в поддержании теломер». В 2022 г. А.И. Калмыкова возглавила лабораторию эпигенетики развития ИБР РАН им. Кольцова, которая продолжит исследования биологии теломер и эпигенетических механизмов регуляции активности транспозонов. Системы модификации хроматина и механизмы регуляции генов с участием коротких РНК являются основными эпигенетическими инструментами, которые позволяют, не затрагивая генетическую информацию, менять активность генов-мишеней.

Эпигенетика теломер

Особое внимание уделяется механизмам регуляции стабильности теломер в развитии и старении на примере модельного объекта Drosophila melanogaster. Теломеры не только защищают концы линейных хромосом, но являются сложным регуляторным локусом генома, задействованным во многих путях, связанных с контролем генетической стабильности. Участие теломер в таких важнейших процессах, как развитие, старение и онкогенез, приковывает внимание исследователей к механизмам регуляции теломерного гомеостаза, которые пока далеки от понимания. В нашем коллективе ведется систематическое изучение консервативных теломерных факторов, а также отбор новых компонентов теломерного комплекса, которые необходимы для регуляции транскрипции теломерных повторов и поддержания теломерного хроматина.

Рис. 1. Экспериментальная стратегия отбора и исследования теломерных факторов (Morgunova et al. 2015).

Методы глубокого секвенирования позволяют выявить на полногеномном уровне мишени исследуемых эпигенетических факторов. Часто мы видим изменения в экспрессии и структуре хроматина не только теломерных повторов, но и других ретротранспозонов.

Рис. 2. Изменение экспрессии теломерных повторов и других ретротранспозонов наблюдается при герминальном нокдауне РНК-связывающего белка Ars2, консервативного теломерного фактора.

В нашем коллективе предложена и развивается концепция теломерного чекпойнта, согласно которой теломеры являются детектором тех нарушений, которые представляют угрозу генетической стабильности клетки, и они же запускают ответ, приводящий к гибели такой клетки или остановке развития. В то же время, дисфункция теломер и повреждения теломерной ДНК при сохранении нормальной длины теломер могут быть причиной ускоренной гибели клеток при старении.

Рис. 3. Накопление рекомбиназы Rad51 (зеленый) в теломерах (теломерный белок HOAP, красный) герминальных клеток Drosophila при старении. В эксперименте были исследованы яичники мух 3- и 50-дневного возраста изогенной линии iso-1 (Моргунова и др. 2022).

В наших работах была выявлена новая сигнальная роль теломерных РНК. Показано, что при нарушении теломерного гомеостаза активируется транскрипция теломерных повторов, в результате чего образуются теломерные рибонуклеиновые комплексы (РНП), способные взаимодействовать с другими белками и РНК (Kordyukova et al. 2018, Morgunova et al. 2021). Взаимодействие теломерных РНП с ключевыми белками клеточного цикла вызывает раннюю остановку развития при дисфункции теломер и гиперэкспрессии теломерных повторов. Такой механизм обеспечивает поддержание стабильности генома в ряду поколений.

Рис. 4. Образование агрегатов теломерных РНК (зеленый) с киназой клеточного цикла Polo (красный) вокруг центросом приводит к нарушению динамики Polo и митотической катастрофе в раннем эмбриогенезе Drosophila. ДНК окрашена синим. Представлены митотические хромосомы в эмбриональном синцитии при нокдауне Ars2, что приводит к активации транскрипции теломерных повторов (Morgunova et al. 2021).

Эпигенетика коротких РНК

Короткие РНК, относящиеся к классу Piwi-interacting RNA (piРНК), играют ключевую роль в контроле активности мобильных элементов в гонадах животных. piРНК в комплексе с белками подсемейства Piwi семейства Argonaute взаимодействуют с комплементарными новообразованными транскриптами мобильных элементов, что приводит к привлечению факторов гетерохроматина на транспозоны и подавление их транскрипции. Мы показали, что, кроме транскрипционного сайленсинга, piРНК также привлекают ядерный деаденилазный комплекс Ccr4-Not, что приводит к котранскрипционной деградации избыточных транскриптов активных транспозонов. В наших работах выявлена новая и очень важная функция piРНК – это способность индуцировать de novo продукцию piРНК в гомологичных локусах генома. Это явление было продемонстрировано на активных геномных копиях транспозонов и подробно исследовано на модельной трансгенной системе. Биологический смысл этого явления состоит в умножении количества piРНК, комплементарных транскрибирующимся копиям мобильных элементов, что усиливает защиту генома от наиболее опасных активных транспозонов.

Рис. 5. piРНК в герминальных клетках могут индуцировать деградацию транскриптов мобильных элементов в ядре (слева) и формирование de novo продукции piРНК из транскриптов активных копий транспозонов (справа).

Мы исследуем также особенности соматического биохимического пути с участием piРНК на социально важном модельном объекте – комарах рода Anopheles. В соматических тканях комаров piРНК участвуют в противовирусном ответе. Анализ библиотек коротких РНК из различных тканей самцов и самок комаров рода Anopheles показывает наличие новых мишеней эпигенетической регуляции с участием piРНК в соматических тканях.

Механизмы регуляции гаметогенеза

Другое важное направление наших исследований связано с изучением механизмов регуляции гаметогенеза. Контроль активности мобильных элементов с участием piРНК является важнейшим фактором, определяющим нормальный ход гаметогенеза и фертильность (О. Sokolova et al., 2020, Scientific Reports. 10(1):1076; O.A. Sokolova et al. 2019, Mol Biol Cell. 30(12):1544-1554).

Рис. 6. Схема основных стадий оогенеза Drosophila melanogaster. Показана схематично овариола, состоящая из гермария и яйцевых камер на разных этапах оогенеза. Гермарий показан в увеличенном виде.

Инсуляторные белки играют также важную роль в процессах гаметогенеза, а их нарушения приводят к стерильности и остановке развития. Однако, учитывая многофункциональность инсуляторных белков, зачастую невозможно выявить механизм их действия и тканеспецифичные мишени. Ноль-мутанты инсуляторного белка BEAF32 Drosophila melanogaster жизнеспособны, но стерильны, что является удобной моделью для исследования роли инсуляторов в регуляции гаметогенеза. Мы проводим полногеномный анализ структуры хроматина, изменений транскрипции генов и представленности коротких РНК, чтобы выявить ключевые мишени BEAF32 в процессе оогенеза Drosophila.

Финансирование проектов

РНФ 22-14-00006 «Механизмы контроля стабильности теломер в зародышевой линии Drosophila», рук. А.И. Калмыкова

РНФ 23-24-00025 «Полногеномный анализ роли инсуляторного комплекса в регуляции транскрипции генов в процессе гаметогенеза», рук. О.А. Соколова.

Избранные публикации

1. Olovnikov I, Ryazansky S, Shpiz S, Lavrov S, Abramov Y, Vaury C, Jensen S, Kalmykova A. De novo piRNA cluster formation in the Drosophila germ line triggered by transgenes containing a transcribed transposon fragment.Nucleic Acids Res. 2013 41: 5757-68, 2013.
2. S. Shpiz, S. Ryazansky, I. Olovnikov, Y. Abramov, A Kalmykova. Euchromatic transposon insertions trigger production of novel pi- and endo-siRNAs at the target sites in the Drosophila germline, PLOS Genetics, 10:e1004138, 2014.
3. Morgunova V, Akulenko N, Radion E, Olovnikov I, Abramov Y, Olenina LV, Shpiz S, Kopytova DV, Georgieva SG, Kalmykova A. Telomeric repeat silencing in germ cells is essential for early development in Drosophila. Nucleic Acids Res. 43: 8762–8773, 2015.
4. E. Radion, S. Ryazansky, N. Akulenko, Y. Rozovsky, D. Kwon, V. Morgunova, I. Olovnikov, A. Kalmykova Telomeric retrotransposon HeT-A contains a bidirectional promoter that initiates divergent transcription of piRNA precursors in Drosophila germline. J. of Mol. Biol. 2017, 429, 3280–3289.
5. S. Ryazansky, E. Radion, A Mironova, N Akulenko, Y. Abramov, V. Morgunova, M. Kordyukova, I. Olovnikov, A. Kalmykova. Natural variation of piRNA expression affects immunity to transposable elements. PLoS Genet, 13(4): e1006731, 2017.
6. Akulenko, S. Ryazansky, V. Morgunova, P.A. Komarov, I. Olovnikov, C. Vaury, S. Jensen and A. Kalmykova Transcriptional and chromatin changes accompanying de novo formation of transgenic piRNA clusters. RNA, 24: 574-584, 2018.
7. M. Kordyukova, I. Olovnikov, A. Kalmykova. Transposon control mechanisms in telomere biology. Current Opinion in Genetics & Development, 49:56-62, 2018.
8. E. Radion, V. Morgunova, S. Ryazansky, N. Akulenko, S. Lavrov, Y. Abramov, P. Komarov, S. Glukhov, I. Olovnikov, A. Kalmykova. Key role of piRNAs in telomeric chromatin maintenance and telomere nuclear positioning in Drosophila germline. Epigenetics Chromatin,11(1):40, 2018.
9. M. Kordyukova, V. Morgunova, I. Olovnikov, P. A. Komarov, A. Mironova, O. M. Olenkina, A. Kalmykova. Subcellular localization and Egl-mediated transport of telomeric retrotransposon HeT-A ribonucleoprotein particles in the Drosophila germline and early embryogenesis. PLOS One, 13, e0201787, 2018.
10. М. Кордюкова, А. Калмыкова. Природа и функции теломерных транскриптов. Биохимия, том 84, вып. 2, с. 212 – 222, 2019.
11. E. Radion, O. Sokolova, S. Ryazansky, P. A. Komarov, Y. Abramov, A. Kalmykova. The Integrity of piRNA Clusters is Abolished by Insulators in the Drosophila Germline. Genes, 10(3), 209, 2019.
12. M. Kordyukova, O. Sokolova, V. Morgunova, S. Ryazansky, N. Akulenko, S. Glukhov, A. Kalmykova. Nuclear Ccr4-Not mediates the degradation of telomeric and transposon transcripts at chromatin in the Drosophila germline. Nucleic Acids Res. 48(1):141-156, 2020.
13. A. Komarov, O. Sokolova,N. Akulenko, E. Brasset, S. Jensen* and A. Kalmykova Epigenetic Requirements for Triggering Heterochromatinization and Piwi-Interacting RNA Production from Transgenes in the Drosophila Germline. Cells 2020, 9(4), 922.
14. V. Morgunova, M. Kordyukova, E.A. Mikhaleva, I. Butenko, O.V. Pobeguts, and A. Kalmykova. Loss of telomere silencing is accompanied by dysfunction of Polo kinase and centrosomes during Drosophila oogenesis and early development. PlosOne, 16(10): e0258156, 2021.
15. В. В. Моргунова, О.А. Соколова Т. В. Сизова, Л. Г. Малаев, Д. С. Бабаев, Д. А. Квон, А. И. Калмыкова. Дисфункция ламина B и физиологическое старение приводят к дестабилизации теломер в герминальных клетках Drosophila. Биохимия, 87, 12, 1972-1984, 2022.