Для этого было отобрано 9 линий ИПСК с мужским кариотипом из доступных депозитариев с наличием информации по полногеномному секвенированию и юридической возможностью дальнейшего распространения: KOLF2_C1, KUCG3, LNGPI1, MS19-ES-H, NCRM1, NCRM5, NN0003932, NN0004297 и PGP1. Далее выбранные линии были клонированы – т.е. получены клоны (сублинии) из единичных клеток каждой линии с единым генетическим и эпигенетическим бэкграундом. Одновременно было проведено CRISPR-Cas9 редактирование для коррекции мутации в одном из аллелей гена ARID2 линии KOLF2-C1, и полученная сублиния названа KOLF2.1J.

Сублинии были подвергнуты ряду тестов для того, чтобы выявить наиболее генетически устойчивые, быстро пролиферирующие, обладающие нужными генетическим и морфологическими характеристиками и дифференцировочным потенциалом.

Сначала были отобраны по 1-4 сублинии каждой линии по морфологическому признаку и с нормальным кариотипом. Все отобранные сублинии имели схожую морфологию, однако отличались по скорости пролиферации и выживаемости клеток. Проточная цитометрия показала, что клетки всех сублиний, за исключением PGP1, были более чем на 90% положительны на маркеры плюрипотентных стволовых клеток TRA-1-60 и NANOG.

Анализ scRNA-seq продемонстрировал, что во всех сублиниях, кроме LNGPI1, экспрессируются гены недифференцированных стволовых клеток, включая SOX2, POU5F1 и NANOG, и что транскрипционные профили сублиний весьма схожи.

При получении ИСПК и селекции клонов в изменяющихся клетках могут появляться генетические мутации, способствующие их росту в культуре. Достаточно часто они возникают в гене супрессии опухолей p53. Поэтому в сублиниях была проверена работоспособность пути р53 и показана его интактность.

Проведя полногеномное секвенирование образцов субклонов, авторы показали, что распределение вставок-делеций, миссенс однонуклеотидных вариаций (SNV) и SNV с потерей функции было одинаковым у сублиний и в сравнении с популяционными выборками из базы данных gnomAD. Также они выявили достаточно небольшую генетическую «предрасположенность» к болезни Альцгеймера и связанным деменциям (ADRD) в исследуемых вариантах ИПСК.

Полученные сублинии, кроме KUCG3, не содержали мозаичных популяций с большим разбросом генетических вариаций и не приобретали их в процессе геномного редактирования.

Способность сублиний поддерживать дифференцировку (с упором на нейральную дифференцировку) была проверена с использованием 4 протоколов: двух на основе малых молекул и двух на основе оверэкспрессии транскрипционных факторов. Было показано, что клетки всех линий всегда дифференцировались в таргетные нейроны (помимо нейронов, незрелых нейронов, нейронных предшественников и других клеток), но при этом эффективность дифференцировки у разных сублиний была разная. Только сублинии KOLF2.1J, NCRM5 и NN неизменно образовывали значительную популяцию именно таргетных нейронов.

Проведя все эти анализы, исследователи в итоге выбрали сублинию KOLF2.1J, поскольку NN0003932 и NCRM1 показали достаточно низкую эффективность геномного редактирования в определенном локусе, KUCG3, NCRM5 и NN0004297 обладали медленным ростом, PGP1 была отсеяна в связи с возможной остаточной экспрессией ею репрограммирующих факторов, а LNGPI1 – из-за нестандартной экспрессии генов в плюрипотентном состоянии и слабого дифференцировочного потенциала. Кроме того, сублиния KOLF2.1J имела генотип APOE3/E3 по аполипопротеину (данная комбинация аллелей у людей связана с пониженным риском развития болезни Альцгеймера).

Ученые считают, что любая референсная линия ИПСК, предназначенная для широкомасштабных исследований, должна быть тщательно проверена на наличие генетических вариантов, которые могут усложнять интерпретацию молекулярного и клеточного фенотипов в дифференцирующихся потомках данной линии. Используя методику дифференциального G-окрашивания для исследования кариотипа, а также метод направленной геномной гибридизации (dGH), они показали, что клетки KOLF2.1J не содержат таковых.

Авторы не обнаружили также значительных различий между потенциалом KOLF2.1J и линии сравнения дифференцироваться в три зародышевых листка путем расчета количества клеток, иммуноположительных на маркеры эндодермы SOX17, мезодермы brachyury, эктодермы Nestin.

Далее исследователи передали образцы сублинии KOLF2.1J в различные лаборатории, 9 из которых в последствии предоставили данные сравнения результативности дифференцировки KOLF2.1J с 12 другими линиями ИПСК при использовании единого протокола дифференцировки или методик, применяемых в данных лабораториях. Была показана дифференцировка KOLF2.1J также в три зародышевых листка, кортикальные глутаматэргические нейроны, кортикальные нейроны переднего мозга, скелетные миоциты, моторные нейроны, астроциты, микроглию, макрофаги, дофаминергические предшественники, нейроны, органоиды (табл. 1)

Эти данные свидетельствуют о том, что KOLF2.1J неизменно дифференцируется в различные функциональные типы клеток центральной нервной системы (глутаматэргические кортикальные нейроны, кортикальные нейроны переднего мозга, моторные нейроны, астроциты).

Убедившись в том, что линия KOLF2.1J обладает необходимыми для модельного объекта свойствами, ученые стали курировать распространение ее и ее производных с отредактированным геномом из лаборатории The Jackson Laboratories через общедоступный веб-сайт (https://www.jax.org/...). Мастер-банк с достаточным количеством клеток KOLF2.1J был создан до начала описанных выше тестов, что гарантирует наличие у распространяемых образцов генетических и фенотипических свойств, показанных в данном исследовании. В дополнение к тому, что клеточная линия легкодоступна, ученые отмечают, что она была получена из материала, взятого по всем правилам и с письменного согласия донора. Видение авторов статьи заключается в том, что глубокая генотипическая и фенотипическая характеризация данной клеточной линии, ее доказанная во многих лабораториях эффективность и ее относительная простота распространения, вероятно, приведут к ее широкому внедрению в исследования групп, стремящихся работать с надежным стандартом иПСК для достижения цели улучшения воспроизводимости и возможности коллаборации в экспериментах данного направления.

Таким образом, авторы статьи уверены, что KOLF2.1J является хорошей модельной линией ИПСК по следующим причинам:
1) ее материнская линия KOLF2-C1 была репрограммирована при помощи неинтеграционных методов в безфидерных условиях с использованием сред и субстратов с известным составом, а ее источник и получение нужным образом задокументированы;
2) материнская линия и KOLF2.1J сохраняли геномную чистоту на протяжении многих раундов CRISPR-Cas9 редактирования;
3) обе линии не имеют вариантов генов, которые могли бы приводить к нарушениям клеточных фенотипов при нейральных дифференцировках;
4) KOLF2.1J показала хорошие результаты во всех проведенных тестах;
5) межлабораторный эксперимент с участием 9 коллективов исследователей показал, что KOLF2.1J обладает необходимыми дифференцировочными свойствами с сравнении с другими линиями ИПСК.

Новость представили ©Алпеева Е.В. и Абдыев В.К.

26.12.2022