Изучение раннего развития эмбрионов млекопитающих затруднено в связи с тем, что после имплантации эмбрионы оказываются скрытыми от исследователей в материнских тканях. В связи с этим одним из новых направлений эмбриологии является создание модельных объектов для изучения раннего пост имплантационного развития эмбриона млекопитающих. В данном исследовании на уже описанной в литературе модели гаструлоидов (Baillie-Johnson et al., 2015; van den Brink et al., 2014) была показана способность клеток мыши в определенных условиях самоорганизовываться и проходить трансформации, напоминающие гаструляцию и элонгацию. Также, развивающиеся гаструлоиды демонстрировали признаки установление осей тела, что тоже имитирует процесс развития эмбриона мыши в норме. Развитие гаструлоидов было подробно изучено в работе при помощи сравнения с нормальными эмбрионами мыши, методов иммунохимии и РНК секвенирования. В обработке данных применялись методы биоинформатики.

Для создания гаструлоидов использовались различные линии мышиных эмбриональных стволовых клеток (в том числе трансфицированные различными флуоресцентными белками), а также различные линии клеток с индуцированной плюрипотентностью. Агрегаты были получены следующим методом: около трехсот мышиных эмбриональных стволовых клеток или около восьмисот клеток с индуцированной плюрипотентностью были необходимы для получения гаструлоида, который бы достигал 150 микрометров в диаметре к моменту 48ми часов после агрегации. Исходные клетки были помещены в капли среды N2B27 и подвергались импульсному воздействию Chi, агониста Wnt. Полученные гаструлоиды наблюдались до момента 168 часов после агрегации, когда они были зафиксированы. Для увеличения продолжительности жизни гаструлоидов они культивировались на неадгезивном пластике при постоянном покачивании.

После пульсового воздействия Chi гаструлоиды начинают удлиняться и в них выделяется пул клеток, экспрессирующих Brachyury. При покачивании в культуре гаструлоиды продолжают элонгироваться до 168 часов после агрегации и могут достигать длины в 1 миллиметр. На 120й час после агрегации у удлиняющегося гаструлоида выделяются два полюса: экспрессирующий Gata6 и экспрессирующий Brachyury и Cdx2, по-видимому, аналогичный закладке сердца, а посередине присутствуют клетки, экспрессирующие Sox1 и 2.

Далее в работе был произведен анализ транскриптомов гаструлоидов при помощи метода секвенирования РНК. В первом эксперименте сравнивались транскриптомы групп гаструлоидов, объединенных по времени, прошедшему после агрегации (для каждой временной точки рассматривали по две группы гаструлоидов) и нормальные мышиные эмбрионы (от которых в исследовании участвовали их пост-затылочные части, наиболее напоминающие гаструлоиды по экспрессируемым маркерам) на разных стадиях развития от Е6,5 до Е9,5. Сравнение проводилось по всем аутосомным генам и для обработки данных использовался математический алгоритм, позволяющий снизить размерность данных: метод принципиальных компонент.

Анализ транскриптомов показал, что группы гаструлоидов, относящиеся к одной временной точке образуют кластеры, которые расположены в порядке увеличения «возраста» гаструлоида друг за другом. Было показано, что элонгация у гаструлоидов и нормальных эмбрионов мыши происходит при помощи одинаковых транскрипционных программ. Кроме того, транскрипционный профиль гаструлоидов на момент 48ми часов после агрегации напоминал профиль нормального эмбриона в начале гаструляции, а через 72 часа после агрегации в транскрипционный профиль гаструлоидов добавилась экспрессия генов маркеров различных эмбриональных линий. Гены, экспрессия которых практически не наблюдалась в гаструлоидах включали в себя гены, экспрессируемые в экстраэмбриональных частях зародыша, а также те, которые относятся к антериальной нейральной пластинке.

Далее был произведен анализ транскриптомов одиночных гаструлоидов. Было подтверждено, что гаструлоиды на определенных этапах развития представляют из себя гомогенную популяцию и данные, полученные на объединенных группах гаструлоидов хорошо отражают общую картину. Анализ транскрипции выявил наличие РНК, характерной для нейральных, эндодермальных и мезодермальных производных. Кроме того, в изменении профиля экспрессии генов по ходу развития гаструлоида были обнаружены паттерны, характерные для антериально-постериальной дифференцировки тех или иных структур по ходу развития зародыша. Однако, несмотря на схожие с нормальными паттерны экспрессии, значимого морфогенеза в структурах гаструлоида не происходило.

Далее у гаструлоидов была проанализирована экспрессия генов, относящихся к установлению осей тела эмбриона, таких как Wnt3a, Cyp26a1 и других. Паттерны экспрессии генов указывали на установление в гаструлоиде всех трех осей тела: антериально-постериальной, дорсо-вентральной и медио-латеральной. Анализ экспрессии Hox генов показал, что временной паттерн активации Hox генов сходен у гаструлоидов и эмбрионов, но, что характерно, в гаструлоидах не экспрессировались те Hox гены, которые свойственны экстраэмбриональным производным. Удивительным было то, что помимо времени активации экспрессия некоторых Hox генов гаструлоида напоминала нормальный эмбрион пространственным паттерном экспрессии.

В данной работе были подробно описаны гаструлоиды, модельные структуры, полученные из эмбриональных стволовых клеток мыши и по некоторым параметрам напоминающие эмбрионы мыши. Была описана морфология гаструлоидов, а также проанализированы уровни экспрессии множества генов и проведено сравнение с паттерном экспрессии эмбриона мыши. Гаструлоиды демонстрируют удивительный уровень самоорганизации, проходят элонгацию и имеют сложный пространственно-временной паттерн экспрессии генов, практически повторяющий то, как экспрессируются данные гены в норме. Несмотря на это, паттерны экспрессии генов в гаструлоиде не подкреплены соответствующим морфогенезом, что является ограничением данной модели. Возможными причинами этого являются отсутствие механических взаимодействий и внешних механических сигналов, которые присутствуют в норме. Несмотря на некоторые ограничения, данная модель, уникальна для изучения раннего эмбрионального развития млекопитающих, гаструлоиды были крайне подробно изучены и описаны в работе, а также была показана их способность к сложной самоорганизации.

Рис. 1 Элонгация гаструлоидов:
a, схема протокола культивирования: 200–300 ESCs агрегировались в культуре; между 48ю и 72мя часами был добавлен агонист Wnt CHIR99201 (Chi); Органоиды культивировали в суспензии до 120ти часов после агрегации после чего культивировали при покачивании до 168ми часов после агрегации.
b, 3D изображения и конфокальные срезы гаструлоидов на временных точках (элонгация и экспрессия BRA, SOX2 и Gata6H2B-Venus (green).

Новость подготовила © Измайлова Л.Ш.

24.10.2018