© Никишина Юлия Олеговна.
Кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории нервных и нейроэндокринных регуляций ИБР РАН.
Изучение работы нервной системы на уровне клеточных взаимодействий всегда было интересной, важной и технически очень непростой задачей. Основным подходом исследователей в данном направлении была электрофизиология. Однако данный метод не дает возможности изучения синаптической пластичности на уровне индивидуального синапса. Это накладывает определенные ограничения при изучении процессов формирования памяти, обучения, а так же различных патологий нервной системы. Несколько лет назад для решения данной проблемы свои усилия объединили двое ученых из Колумбийского университета США: Dave Sulzer (нейрофизиолог) и Dalibor Sames (биоорганик). Их сотрудничество оказалось весьма плодотворным: они создали методологию синтеза флуоресцентных молекул, схожих по своим свойствам с основными нейротрансмиттерами, так называемые «флуоресцентные ложные нейротрансмиттеры (fluorescent false neurotransmitters, FFN)». Суть данной методологии заключается в том, что исследователи не просто сшивали флуорофор с субстратом, а создавали совершенно новую молекулу, которая объединяла низкомолекулярный флуорофор и ключевые структурные особенности субстрата. Ранее была получена молекула FFN107, которая по своим способностям связывания с мембранным транспортером дофамина (DAT) и везикулярным транспортером моноаминов (VMAT2) очень близка дофамину. С использованием данной молекулы уже вышла серия работ по исследованию синаптической пластичности и визуализации выделения дофамина из индивидуальных пресинаптических терминалей.
Следующим этапом работы данной группы ученых стало применение разработанной ими методики для синтеза флуоресцентных аналогов других нейротрансмиттеров. Так, данная работа посвящена созданию флуоресцентного оптического трейсера – аналога норадреналина, а также изучению возможности ее использования для визуализации отдельных норадренергических синапсов и их активности.
В качестве основы разрабатываемого FFN, был выбран кумариновый флуорофор, в структуру которого был включен основной структурный компонент норадреналина – фрагмент арилэтиламина (рис. 1). Кумариновый флуорофор являлся оптимальным для создания FFN, так как имеет низкомолекулярную структуру, которая не мешает связыванию специфического для норадреналина фрагмента с мембранным транспортером норадреналина и проникновению молекулы в клетку. Кроме того, данный флуорофор имеет достаточно высокую яркость флуоресценции и фотостабильность. Полученную таким образом молекулу авторы назвали FFN270. Способность данной молекулы специфически связываться с мембранным транспортером норадреналина (NET) и VMAT2 была изучена на трансгенных культурах клеток HEK-NET и HEK-VMAT2. В ходе данного эксперимента было показано, что FFN270 специфически связывается с NET (при этом не связывается с DAT и SERT) и проникает внутрь клетки, где транспортируется в везикулы с помощью VMAT2.
Рис. 1 – Струкстура и свойства FFN270
В следующей серии экспериментов авторы проверили действие FFN270 в условиях ex vivo на срезах мозга, включающих область голубого пятна. В данном эксперименте были использованы трансгенные мыши, под промотором тирозингидроксилазы которых экспрессировался GFP-белок. В области голубого пятна тирозингидроксилаза является маркером норадренергических нейронов (рис. 2). Было показано, что FFN 270 выявляется в 75% норадренергических нейронов. Специфический ингибитор NET-ребоксетин отменял данный эффект.
Рис. 2 – Метка FFN270 в норадренергических нейронах голубого пятна. b – метка FFN270 (желтая стрелка); c – метка GFP (синяя стрелка); d – колоколизация меток GFP и FFN270 (красные стрелки)
В третьей серии экспериментов авторы демонстрируют возможности прижизненной визуализации норадренергических аксонов в мозге животных при помощи бифотонной микроскопии (рис. 3).
Рис. 3 – Визуализация норадренергических аксонов и сайтов выделения норадреналина на живых животных (a) и трехмерная реконструкция норадренергических аксонов, меченных FFN270 в соматосенсорной коре (b).
Флуоресцентные ложные нейротрансмиттеры открывают новые возможности для нейробиологов при изучении синаптической пластичности, связанной с такими процессами как память, обучение, а так же при различных патологиях мозга. Особый интерес, конечно, вызывает возможность использования данных молекул на живых животных. Однако немалый интерес данный вид молекул представляет и для биологов развития при изучении роли нейротрансмиттеров на разных этапах онтогенеза. Ранее функциональную активность той или иной трансмиттерной системы можно было изучать лишь с использованием фармакологических агентов (ингибиторов транспортеров, рецепторов и т.д.), которые далеко не всегда являются строго специфичными. Очень хотелось бы верить, что флуоресцентные ложные нейротрансмиттеры способны помочь нам в решении столь сложных задач.
Новость подготовила © Никишина Ю.О.
24.08.2018