Исследование зиготы на стадии дробления представляет интерес для эмбриологии, генетики, клеточной и молекулярной биологии, а также регенеративной медицины из-за уникальных генетических и эпигенетических процессов, которые происходят во время активации генома и промежуточного тотипотентного состояния клеток в составе зародыша. В состоянии тотипотентности стволовые клетки способны дифференцироваться в любой тип клеток человеческого организма. Однако изучение этой стадии в моделях развития человеческой зиготы затруднено из-за биоэтических ограничений (1). В обозреваемой работе авторам удалось разработать метод, позволяющий быстро, эффективно и без использования инструментов редактирования генома привести ПСК (плюрипотентные стволовые клетки человека) в состояние аналогичное стадии 8-ми бластомеров в эмбриогенезе человека- 8CLC (8C-like cells).

К стволовым клеткам с наибольшим потенциалом дифференцировки относят тотипотентые, наивные плюрипотентные и праймированные плюрипотентные. Тотипотентные клетки способны дифференцироваться в любой тип клеток организма и клеток внезародышевых листков, наивные плюрипотентные клетки отличаются меньшей эффективностью в некоторых типах дифференцировки и по экспрессии ряда генов, а праймированные содержат инактивированную Х-хромосому и не могут встраиваться в бластоцисту, а также не способны дифференцироваться в клетки внезародышевых листков и во все типы клеток организма (2). В ходе первых нескольких делений зигота сохраняет тотипотентные клетки, однако в условиях in vitro в культуре наивных ИПСК (индуцированных плюрипотентных стволовых клеток) мыши только 0.5% клеток могут находиться в состоянии, аналогичном стадии 2-х бластомеров (3). Что же касается культур ПСК (плюрипотентных стволовых клеток) человека в наивном состоянии, анализ РНК секвинирования показал, что у них лишь незначительно проявляется активация отдельных генов тотипотентности (4). Все ранее полученные линии наивных чИПСК были праймированы относительно стадии 8-ми бластоцистов. В то же время работы с эмбриональным материалом на этой стадии были ограничены из-за его редкости и этических аспектов работ с эмбриональным материалом человека в некоторых странах. Для решения этой проблемы авторы решили применить селективный эмпирический подход с целью подобрать условия, при и которых фенотип наивных ПСК будет максимально приближен к фенотипу клеток на стадии 8CLC. Для этого исследователи, использовали фидерный метод культивирования чИПСК с мышиными эмбриональными фибробластами (МЭФ), внесли в культуральную среду с N2 и B27, витаминами А и С, PD-0325901 (ингибитор FGF (фактор роста фибробластов) сигнального пути) , IWR1 (ингибитор танкиразы и WNT-сигнального пути), активином (поддержание экспрессии генов плюрипотентности) и LIF (лейкемия-ингибирующий фактор) человека (поддержание экспрессии гена плюрипотентности OCT4), достигая таким образом максимального уровня экспрессии генов наивной плюрипотентности в колониях ПСК и препятствую спонтанной дифференцировке. На следующем этапе исследователи применили другой коктейль факторов, в базовую среду они добавили DZNep (3-Деазанепланоцин А, ингибитор метилтрансферазы гистона H2), TSA (трихостатин А, ингибитор деацетилазы гистонов H3 в положении K27), PD0325901, IWR-1 , LIF человека. Полученную среду они назвали 4CL. Затем был иcследован эффект повышенного содержания TSA и DZNep в среде (Среда e4CL). Через 5 дней после изменений у ПСК было зафиксировано увеличение экспрессии генов тотипотентности (TPRX1, ZSCAN4, ZSCAN5B, DUXA/B и ZNF280A) (Рис. 1 Б, В).

Однако в результате, полученную при помощи такой комбинации факторов в среде, линию оказалось невозможно продолжительно культивировать из-за потери пролиферативного потенциала. Чтобы исправить это, фидерную культуру с исходно праймированными чИПСК и чЭСК культивировали поочередно в средах 4CL и e4CL, подбирая оптимальные условия для получения стабильной 8CLC субпопуляции в культуре. В результате команде ученых удалось разработать 2 способа получения линии плюрипотентных клеток со стабильным присутствием тотипотентной субпопуляции клеток. Первый из этих способов подразумевает последовательное культивирование ПСК сначала одни сутки в среде 4CL, а затем еще 4 суток на среде e4CL, второй способ подразумевает прямую репрограммирование праймированных ПСК исключительно в среде e4CL в течение 7 суток. Доказательством появления тотипотентной субпопуляции в культуре является повышенный уровень экспрессии генов тотипотентности (TPRX1, ZSCAN4, ZSCAN5B, DUXA, KHDC1L, DPPA3, KLF17, MBD3L2 и ZNF280A) (рис. 2) При этом выход нужной субпопуляции тотипотентных клеток достигает 5%.

Следующим этапом данного исследования было изучение генетических и эпигенетических изменений, происходящих во время конверсии праймированных ПСК в состояние 8CLC. Сначала был проведен сравнительный анализ доли метилированной ДНК в ядрах ПСК при помощи метода бисульфитного секвенирования генома. В результате, в случае состояния 8 CLC в сравнении с наивными или праймированными ПСК можно наблюдать пониженный процент метилированной ДНК. В то же время тотипотентные гены также более деметилированы, что коррелирует с уровнем их экспрессии (рис 3).

Также команда ученых, используя метод scATAC-seq, сравнила уровень компактизации хроматина в участках ДНК, где располагаются различные группы генов, в ядрах клеток 8СLC линии, полученной по методу последовательной конверсии, с наивными ПСК, полученными при помощи 12-ти дневного культивирования на среде 4CL. В результате в клетках 8СLC линии вокруг генов тотипотентности (TPRX1, ZSCAN4, ZNF280A, ARGFX и DPRX), GATA6 (примитивная энтодерма), PITX2 (мезодерма и энтодерма), GSC (мезодерма) хроматин был менее компактизован в сравнении с более праймированными клетками, что характерно и для клеток положительного контроля. В экспрессии генов плюрипотентности между наивными, праймированными клетками и 8CLC также наблюдались различия, причем эти различия имели одни и те же паттерны в соответствии с определенными участками хроматина, что позволяет предполагать наличие механизма, обеспечивающего контроль компактизации хроматина и изменение уровня транскрипции этих групп генов как при формировании тотипотентных клеток, так и при дифференцировке тотипотентных клеток в праймированные в ходе эмбриогенеза. Также вызванное TSA ацетилирование гистонов H3 в положении К9 коррелирует с декомпактизацией хроматина в локусах, связанных с гистонами этого типа.

Для завершения анализа изменений, происходящих с ПСК при конверсии в 8CLC стадию, исследователи решили выявить сети регуляторных генов (СРГ), которые участвуют в формировании и поддержании данного фенотипа, при помощи single cell WGCNA (сетевой анализ коэкспрессии ключевых генов). В результате конверсии в 8CLC у 449 генов экспрессия увеличивается и лишь у незначительного числа генов снижается. К ключевым генам-регуляторам в ходе процесса конверсии отнесли TPRX1, ZSCAN4, ZNF280A, DUXA и DPPA3. В случае с DPPA3 удалось установить, что его оверэкспрессия в праймированных клетках приводит к ядерно-цитоплазматическому перемещению UHRF1 в праймированных ПСК, а его нокаут приводит к увеличению процента метилированного ДНК в ядре, в частности в генах плюрипотентности (DPPA5 и KHDC3L) и тотипотености (TPRX1 и TRIM43).

В заключительной стадии исследования был протестирован функциональный потенциал полученной линии тотипотентных ПСК. Для этого из полученных в результате конверсии 8CLC были сформированы эмбриональные тельца, которые образовали бластоиды (бластоцистоподобные структуры, полученные в результате дифференцировки тотипотентных или наивных плюрипотентных клеток, содержащие аналоги трофоэктодермы и внутренней массы бластоцисты). Помимо этого, полученные меченные 8CLC были успешно интегрированы в состав зародыша и имплантированы в мышь. Развитие бластоцисты в полученной химерной модели продолжалось до E 10.5. Также линию 8CLC протестировали на формирование тератом. Результирующие тератомы из 8CLC содержали 24 разных типа клеток и по своей морфологии отличались от полученных из наивных и праймированных ПСК тератом (рис. 4).

Таким образом, в ходе данной работы был разработан метод получения тотипотентной линии клеток. Данная линия была верифицирована при помощи иммуноцитохимического анализа, количественного ПЦР анализа, РНК одноклеточного секвенирование и секвенирования популяций клеток и прошла все необходимые функциональные тесты (формирование тератом, интеграция в бластоцисту мыши с формированием химерных зародышей). Помимо этого, авторы сравнили локусы метилированых генов, а также профили экспрессии генов плюрипотентности и тотипотентности в полученной линии клеток в сравнении с праймированными и наивными ПСК, получив сопоставимые с группой положительного контроля паттерны метилирования ДНК и высокие уровни экспрессии ключевых генов плюрипотентности (OCT4, NANOG и др.) и тотипотентности (TPRX1, ZSCAN4, ZSCAN5B, DUXA, KHDC1L, DPPA3, KLF17, MBD3L2 и ZNF280A). Параллельно были проанализированы сети регуляторных генов, которые участвовали в процессе конверсии и поддержании тотипотености, как и ключевые индукторы, стимулирующие активацию этих генов. В результате к ключевым генам, контролирующим процесс конверсии и поддержания 8CLC фенотипа, отнесли TPRX1, ZSCAN4, ZNF280A, DUXA и DPPA3. Результаты этого исследования можно использовать для дальнейшего изучения ранних стадий эмбрионального развития человека, а также механизмов, лежащих в основе индукции и поддержания тотипотености на генетическом и эпигенетическом уровнях.

1. Manor, Y. S., Massarwa, R. & Hanna, J. H. Establishing the human naive pluripotent state. Curr. Opin. Genet. Dev. 34, 35–45 (2015).

2. Jennifer Nichols, Austin Smith. Naïve and primed pluripotent states. Nature 4, 6, 487-492 (2009).

3. Yang, J. et al. Establishment of mouse expanded potential stem cells. Nature 550, 393–397 (2017).

4. Wang, Y. et al. Unique molecular events during reprogramming of human somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPSCs) at naive state. eLife 7, e29518 (2018).

Новость подготовили
© Вепа Абдыев и Андрей Рябинин
20.06.2022