новости биологии развития

В работе была создана уникальная модель для исследования имплантации и раннего развития млекопитающих. Была получена бластоцистоподобная структура, состоящая исключительно из стволовых клеток мыши -- бластоид. Бластоид сходен с бластоцистой на сроке развития 3,5 суток по строению, экспрессии генов и способен имплантироваться в стенку матки мыши. Хотя бластоид и не способен развиваться в полноценный эмбрион, он генерирует клетки, экспрессирующие маркеры многих постимплантационных производных трофобласта. Преимущества данной модели связаны с тем, что бластоид можно изучать в течение длительного времени, тогда как бластоциста в норме быстро развивается, кроме того данная модель является более пластичным конструктом, чем бластоциста, что позволяет детальнее изучать взаимное влияние стволовых эмбриональных клеток и клеток трофобласта.

Бластоиды конструировали из эмбриональных стволовых клеток и стволовых клеток трофобласта. Эмбриональные стволовые клетки были высажены в микролунки. Далее на полученные агрегаты в течении 24-х часов сверху были высажены стволовые клетки трофобласта. В течение следующих 65-ти часов наблюдалось формирование бластоидов: стволовые клетки трофобласта окружали эмбриональные стволовые клетки со всех сторон, а внутри бластоида образовывалась полость. Стимуляция сигнальных путей WNT и cAMP увеличила эффективность формирования бластоидов и образования полости в них.

Далее были тщательно изучены свойства полученных бластоидов. Сначала провели сравнение полученных структур с бластоцистами. По числу клеток и морфологии бластоиды более всего напоминают бластоцисту на сроке развития 3,5 суток. Уровни экспрессии маркеров плюрипотентности (OCT4 и NANOG) во внутренней клеточной массе бластоида были сходны с бластоцистой, но и во внутренней клеточной массе и в трофобласте бластоидов наблюдалась пониженная, по сравнению с нормальными бластоцистами, экспрессия маркера трофобласта: CDX2. Добавление FGF4 и TGFb1 повысило уровень экспрессии CDX2 клетками бластоида, но он все еще оставался низким по сравнению с нормой. Было обнаружено, что добавление в среду IL11 или 8Br-сAMP вместе с FGF4 и TGFb1 способствует поддержанию экспрессии CDX2 и других маркеров трофобласта на уровне, наблюдаемом в клетках нормальной бластоцисты.

При инъекции клеток бластоида в развивающуюся бластоцисту введенные клетки участвуют в образовании эмбриональных и экстраэмбриональных тканей, как это делают эмбриональные стволовые клетки и клетки трофобласта, полученные из нормальной бластоцисты. Таким образом, было показано, что среда бластоида поддерживает способность клеток к дальнейшему развитию и дифференцировке.

Децидуализация (трансформация эндометрия, необходимая для имплантации зародыша и дальнейшего развития) - это комплексный процесс, регулируемый гормональным циклом и эндометрием. У грызунов начало децидуализации связано также с сигналами, поступающими от эмбриона. Авторы показали, что бластоиды способны вызывать децидуальные изменения в матке так же, как и нормальные бластоциты. При внесении в матку бластоида наблюдались ключевые аспекты децидуализации, включающие в себя: изменение клеток эндометрия, анастомозы трофобласта и сосудистой системы матери, а также экспрессию ключевого регулятора децидуализации (ALDH3A1) клетками матки.

Кластерный анализ транскриптомов показал, что бластоид более схож с бластоцистой, чем с материнскими клеточными линиями. Кроме того, сравнение показало, что транскриптом, полученный при помощи виртуально объединенных транскриптомов материнских клеточных линий не схож с транскриптомом бластоида. Таким образом, клетки бластоида взаимодействуют, что обуславливает изменения профиля их транскрипции.

Далее, при помощи метода секвенирования единичных клеток было произведено сравнение транскриптомов клеток бластоида, материнских клеточных линий и стволовых клеток (эмбриональных и трофобласта), культивируемых раздельно друг от друга в среде, по составу идентичной той в которой культивируются бластоиды. Последние при данных условиях культивирования образуют трофосферы (из клеток трофобласта) и эмбриональные тельца (из эмбриональных стволовых клеток.) Кластерный анализ данных секвенирования показал, что по профилю транскрипции можно выделить две большие группы: эмбриональные клетки и клетки трофобласта. Кроме того было обнаружено, что основные маркеры клеток трофобласта сохраняются на клетках, культивируемых в составе бластоида, а клетки трофосфер, которые культивировались в отсутствии клеток эмбриональной линии утрачивают данные маркеры и по профилю экспрессии больше напоминают постимплантационные клетки плаценты.

В норме при развитии бластоцисты трофоэктодерма развивается и организуется под влиянием сигналов, поступающих от клеток эмбриональной линии. Чтобы проверить, влияют ли сигналы эмбриональных стволовых клеток на организацию стволовых клеток трофобласта в бластоиде, эмбриональные клетки в бластоиде были заменены на клетки других клеточных линий. Из различных типов клеток, только клетки культуры эпибласта, культивируемые вместе со стволовыми клетками трофобласта дали образование бластоидов. Кроме того, бластоиды, образованные таким способом, были меньше обычных по размеру. Полученные результаты вероятнее всего объясняются тем, что эмбриональные стволовые клетки в бластоцисте и в бластоиде поддерживают пролиферацию и самообновление в клетках трофоэктодермы за счет секреции ключевого регулятора MAPK сигналинга и клеточного цикла в клетках трофоэктодермы: FGF4. С этими данными согласуется и то, что при увеличении числа эмбриональных стволовых клеток в лунке увеличивался и процентный выход образования бластоидов и их размер. Кроме того, в тесте на способность вызывать децидуальную реакцию бластоиды превосходят трофосферы. Таким образом было показано, что эмбриональные клетки в бластоиде поддерживают пролиферацию трофобласта и предотвращают дифференцировку клеток трофобласта в постимплантационные клетки плаценты.

Если обобщить полученные результаты, то в работе была создана уникальная модельная структура из стволовых клеток, напоминающая бластоцисту по морфологии, экспрессии маркеров и взаимодействию с тканями материнского организма. На данной модели возможно изучение взаимодействия клеток внутри бластоцисты, моделирование имплантации и других процессов, связанных с данной стадией развития, а ключевое преимущество данной модели заключается в том, что бластоид в отличие от бластоцисты имеет существенно больший период времени, когда он остается неизменным и доступен для изучения.