В последние годы активно развивается направление воспроизведения полного процесса гаметогенеза в культуре. В работе «Complete Meiosis from Embryonic Stem Cell-Derived Germ Cells in vitro» (Zhou et al. Cell Stem Cell. 2016 doi: 10.1016/j.stem.2016.01.017) были получены мужские гаметы из ЭСК мыши. В работе «Offspring from oocytes derived from in vitro primordial germ cell-like cells in mice» (Hayashi et al. Science. 2012 doi: 10.1126/science.1226889) клетки, подобные первичным половым клеткам (ППК), были получены из женских ЭСК и иПСК мыши. Эти клетки смешивали с суспензией клеток эмбрионального яичника, культивировали непродолжительное время и трансплантировали под бурсу яичника иммунодефицитных мышей, где происходили их дифференцировка, рост и созревание; в результате после процедуры экстракорпорального оплодотворения от таких, частично выращенных в культуре ооцитов было получено фертильное потомство. В исследовании, опубликованном в 2016 г. этой же группой исследователей (Complete in vitro generation of fertile oocytes from mouse primordial germ cells. Morohaku et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2016 doi: 10.1073/pnas.1603817113), впервые был полностью реконструирован процесс оогенеза мыши в культуре, начиная с первичных половых клеток и заканчивая зрелыми ооцитами на стадии метафазы II деления мейоза, способными к оплодотворению и образованию жизнеспособного потомства. Наконец, в последней статье этих исследователей, опубликованной в Nature в ноябре 2016 г. (Reconstitution in vitro of the entire cycle of the mouse female germ line), совмещены методические подходы, использованные в двух предыдущих статьях, и процесс оогенеза мыши воспроизведен в культуре полностью, начиная с ЭСК мыши, через стадию ППК-подобных клеток, стадии дифференцировки, роста и созревания ооцитов, и заканчивая зрелыми ооцитами, которые, после оплодотворения, давали жизнеспособное фертильное потомство.

Необходимо отметить, что бóльшую часть времени в культуре половые клетки взаимодействовали с соматическими клетками яичника, полученными из 12.5-суточных эмбрионов. ППК-подобные клетки, как в статье в Science 2012 г., смешивали с клетками эмбрионального яичника, в результате чего формировались клеточные агрегаты, так называемые реконструированные яичники. Их культивировали в течение трех недель на границе жидкость/газ в специально подобранных средах, с добавлением ингибитора эстрогенов ICI182780, важность которого была продемонстрирована в статье 2016 г. в PNAS. К концу этого периода культивирования в агрегатах сформировались вторичные фолликулы, содержащие первичные ооциты, происходящие из in vitro дифференцированных ППК-подобных клеток, и клетки гранулозы – из клеток эмбрионального яичника. Далее реконструированные яичники разделяли на отдельные фолликулы и культивировали 11 сут в среде с гонадотропинами, вызывающими рост фолликулов. Получившиеся кумулюс-ооцитные комплексы переносили в среду, способствующую созреванию ооцитов. В итоге получали ооциты на стадии метафазы II деления мейоза, с выделившимся первым полярным тельцем.

Обращает на себя внимание объем проделанной работы: авторы не только продемонстрировали реконструкцию всего оогенеза in vitro на большом статистическом материале, но и проанализировали качество прохождения мейоза в культуре, проверили паттерны метилирования ДНК в полученных ооцитах, провели сиквенс поли(А) РНК ооцитов, полученных in vitro и in vivo, чтобы оценить схожесть процессов дифференцировки половых клеток, и др. Кроме того, для подтверждения воспроизводимости и надежности разработанной методики, авторы воспроизвели весь процесс оогенеза in vitro с последующим оплодотворением на другой линии ЭСК мыши, а также на двух линиях иПСК, полученных из эмбриональных фибробластов мыши, и двух линиях иПСК, полученных из фибробластов взрослых мышей. Наконец, бластоцисты, полученные в результате оплодотворения дифференцированных in vitro ооцитов, были использованы для получения линии ЭСК; из клеток этой линии также удалось дифференцировать ооциты в культуре, уже по второму кругу (рисунок).

Несмотря на в целом успешное воспроизведение оогенеза in vitro, авторы отмечают ряд нарушений в процессе дифференцировки ооцитов в культуре. Так, при мейозе в культуре значительно увеличивается частота асинапсиса между гомологичными хромосомами на стадии пахитены I деления мейоза (53.8% у культивируемых ооцитов по сравнению с 5.3% in vivo) и частота анеуплоидии у зрелых ооцитов. Кроме того, судя по данным секвенирования РНК, несколько нарушен рост ооцитов в культуре. В результате этих нарушений только 3.5% 2-клеточных эмбрионов успешно развивались до взрослых особей, в то время как в случае in vivo дифференцированных ооцитов аналогичный показатель равен 61.7%. Лимитирующим фактором в своей методике авторы статьи называют необходимость использования эмбриональных соматических клеток яичника и, для полного переноса гаметогенеза in vitro, считают необходимым создание методики получения этих клеток из ЭСК или иПСК.

В любом случае, разработанная авторами работы методика получения ооцитов in vitro, проверенная на нескольких линиях клеток, позволяющая получать от дифференцированных в культуре гамет жизнеспособное фертильное потомство, пусть пока и в небольшом проценте случаев, является настоящим прорывом в области фундаментальной науки, репродуктивной биологии и медицины.

© Copyright © 2016 Kulibin A.Yu.