Церебральные органоиды (в англ. яз. лит-ре встречается как cerebral organoids, brain organoids, или neural organoids) происходят из линий человеческих плюрипотентных (ES или iPS) стволовых клеток и являются трехмерными клеточными структурами, которые формируются в культуре in vitro при определенных условиях, воспроизводя до некоторой степени морфогенез сразу нескольких областей мозга человека (Lancaster et al., 2013). Считается, что такие «минимозги» могут выступать в качестве 3D модели для изучения уникальных именно для человека механизмов, лежащих в основе нормального морфогенеза мозга и развития неврологических заболеваний. В частности, церебральные органоиды уже были использованы в качестве модели для изучения генетических основ развития аутических расстройств и механизмов микроцефалии, вызываемой Зика вирусом (Quadrato et al., 2016). В основе формирования церебральных органоидов лежит способность клеток к самоорганизации, которая может быть дополнена экзогенными морфогенетическими факторами. В последнем случае можно направлено получать органоиды, которые имеют признаки характерные для определённых областей мозга.

Одним из главных достоинств церебральных органоидов является возможность их выращивания из iPS клеток, полученных от взрослых пациентов с известной клинической картиной психического заболевания, что безусловно открывает неограниченные перспективы в изучении молекулярных и клеточных механизмов развития неврологических заболеваний со сложной генетикой. Кроме того, пациент-специфические церебральные органоиды могут быть использованы для предсказания эффективности различных фармакологических препаратов в каждом конкретном случае. Однако, модель церебральных органоидов имеет ряд ограничений. По мере роста ухудшается доступ кислорода, а также питательных веществ к внутренним структурам органоидов, приводя к массовой гибели клеток. Это накладывает ограничение на степень созревания органоидов in vitro, т.е. органоид погибает раньше, чем появляются признаки функциональной нервной ткани. Другими словами, модель церебральных органоидов фактически позволяет воспроизвести только начальные этапы развития мозга. В то же время, сложные психические расстройства как раз проявляются на более поздних этапах созревания мозга, когда происходит установление синаптических контактов, образование вспомогательных клеток мозга – астроцитов и олигодендроцитов, и миелинизация. Сюда же необходимо отнести и проблему отсутствия в церебральных органоидах клеток микроглии. Эти клетки происходят из желточного мешка и заселяют мозг уже на ранних этапах эмбриогенеза. Хорошо известно, что клетки микроглии участвуют в «поедании» избыточных синаптических контактов, а нарушение регуляции этого процесса приводит к развитию некоторых психических заболеваний, в частности, шизофрении.

В только что опубликованной работе в журнале Nature Biotechnology (Mansour et al., 2018) авторы попробовали преодолеть обсуждаемые ограничения модели церебральных органоидов путем их имплантации в мозг животных (иммунодефицитных мышей). Церебральные органоиды получали из ES клеток человека линии H9, которые предварительно трансдуцировали лентивирусом с репортерным геном gfp, и затем имплантировали в предварительно подготовленную полость в ретроспленальной коре. Пересаженные церебральные органоиды человека переживали более 180 дней в мозгу мышей. Клетки в них дифференцировались в нейроны, астроциты и олигодендроциты. Хотя сами имплантаты оставались компактными, отростки дифференцированных нервных клеток распространялись далеко за пределы области имплантации. При этом имплантированные клетки человека устанавливали синаптические связи с нейронами мозга реципиента. Методами электрофизиологии, кальциевого имиджинга и оптогенетики было подтверждено, что нейроны имплантатов обладают спонтанной электрической активностью и генерируют вызванные потенциалы действия. Двухфотонная микроскопия показала врастание кровеносных сосудов реципиента в имплантированные церебральные органоиды человека, а также циркуляцию крови в них. Кроме того, клетки микроглии реципиента заселяли имплантированные органоиды.

Хотя авторам безусловно удалось преодолеть проблему васкуляризации церебральных органоидов, тем самым продлив их жизнь и созревание, невозможно не заметить, что с точки зрения нейробиологии в работе не представлено ничего нового. Трансплантация зачатков или культивированных клеток эмбрионального мозга человека грызунам является достаточно отработанной экспериментальной парадигмой, а все выводы обсуждаемой работы о том, что происходит с трансплантатами, были вполне предсказуемыми. Чтобы хотелось видеть в подобной работе нам, как читателям? Во-первых, для получения церебральных органоидов можно было взять не только «здоровые» ES клетки, но и, например, iPS клетки, полученные от пациента с известной клинической картиной психического заболевания. Это позволило бы авторам в явном виде продемонстрировать, что только имплантированные органоиды достигают той степени созревания, на которой начинают проявляться признаки заболевания. Во-вторых, хотелось бы увидеть оценку (и не только качественную, но еще и количественную) того, насколько степень интеграции и созревания церебральных органоидов воспроизводится от мыши к мыши в терминах количества сосудов или общего тока крови, паттерна связей (количество синаптических контактов и карта нервных проекций) как внутри органоидов, так и с нейронами реципиента, клеточного состава. Воспроизводимость является одним из главных качеств любой модели. Таким образом, создаётся впечатление, что обсуждаемая работа является очень поверхностной, а полученные результаты нельзя трактовать, как создание законченной модели с известными качествами.

Что можно было бы сказать вообще о модели с имплантацией церебральных органоидов за рамками содержания обсуждаемой работы? Безусловно, имплантация решает проблему васкуляризации церебральных органоидов и, как следствие, обеспечивает их созревание. Однако, эта модель имеет ряд недостатков. Во-первых, имплантировав органоиды, мы искусственно ограничиваем их доступность как для доставки различных веществ (гематоэнцефалический барьер), так и для наблюдения за ними (трудоемкая техника прижизненных наблюдений). Во-вторых, не понятно – как оценивать вклад взаимодействия органоид-реципиент в наблюдаемую картину созревания органоида. В-третьих, в этой модели невозможно полностью автоматизировать процесс и исключить участие экспериментатора. Это сильно ограничивает проведение скрининговых экспериментов, когда одновременно анализируется множество параметров и/или тестируется влияние множества веществ. В противоположность этому, культивирование церебральных органоидов in vitro и постановку на них экспериментов теоретически возможно автоматизировать, обеспечивая таким образом высокую пропускную способность для подобных экспериментов. Возможность проводить скрининговые эксперименты является критически значимым фактором в выборе модели для изучения молекулярных и клеточных механизмов психических заболеваний, которые, как правило, вызываются множественными нарушениями как на молекулярном, так и на клеточном уровнях. Кроме того, среди пациентов с одинаковым диагнозом наблюдается сильная вариабельность таких нарушений. Таким образом, в контексте моделирования сложных психических заболеваний у человека разработка подходов к длительному культивированию церебральных органоидов in vitro совместно с клетками микроглии, для которых уже опубликованы протоколы получения из плюрипотентных клеток, кажется на сегодняшний день более перспективной, чем имплантация органоидов в мозг животных.

Lancaster MA, Renner M, Martin CA, Wenzel D, Bicknell LS, Hurles ME, Homfray T, Penninger JM, Jackson AP, Knoblich JA. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 2013 Sep 19;501(7467):373-9.

Quadrato G, Brown J, Arlotta P. The promises and challenges of human brain organoids as models of neuropsychiatric disease. Nat Med. 2016 Nov;22(11):1220-1228.

Новость подготовил © 17.05.2018 Подгорный О.В.