В сообщении приведу несколько примеров экспериментальной и клинической работы, которая ведется с целью восполнения значительно сниженного или утраченного зрения у человека. Сегодня эта работа строится на достижениях современных биологических подходов и технологий, а именно, в первую очередь, на использовании индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs), получения из них клеточных продуктов, и попыток с их помощью заместить погибшую или поврежденную ткань глаза (чаще всего сетчатку). Другим подходом является геномодификация при использовании технологии CRISPR/Cas9 для устранения генетических дефектов, приводящих к патологии развития сетчатки и потере зрения, например пигментному ретиниту. Многое, как мы увидим, удается в лабораторных экспериментах, но с трансляцией результатов в медицинскую практику дело обстоит сложнее.

Итак, впервые осуществлена попытка терапии пигментного ретинита (retinitis pigmentosa, RP) на мышиной модели с использованием CRISPR/Cas9 технологии. RP – врожденное заболевание, генетически вариабельное, обусловленное нарушениями более чем в 60 генах с 3000-ми мутаций дает все основания действовать с помощью генотерапии. Zhijian Yu с коллегами разработали CRISPR sgRNA, мишенью которой является сетчаточный транскрипционный фактор Nrl (neural retina leucine zipper), ответственный за созревание палочек в развивающейся и их поддержание во взрослой сетчатке (Yu et al. 2017). Доставка Nrl targeted sgRNA и Cas9 эндонуклеазы осуществлялась непосредственно в сетчатку мышей с помощью двух адено-ассоциированных вирусных (AAV) векторов. Известно, что RP обусловлено постепенной гибелью вначале палочек в сетчатке (которые не только отвечают за ночное зрение, но и поддержавают структурно и трофически колбочки), а затем и колбочек. Роль фактора Nrl заключается в поддержании функционирования палочек, а элиминация его приводит к частичной конверсии палочек в колбочки и, что намного более существенно, является условием поддерживающим жизнеспособность колбочек.

Предлагаемая технология прямой доставки в сетчатку млекопитающих и человека конструкции AAV, опосредованной CRISPR/Cas9, как показали эксперименты на мышах, работает при разных формах дегенерации сетчатки, вызванной PR. Инъекции проводили двухнедельным мышам, а наблюдения велись 3-4 и 6 месяцев спустя. В результате вначале происходило значительное снижение экспрессии Nrl , а затем down-регуляция палочковых генов и up-регуляция колбочковых, а также ингибирование гибели колбочковых клеток (рис.1). Однако в данном случае, являющимся безусловным успехом, эксперименты осуществлены на мышиной модели, где в развитии патологии задействован не один, а 67 генов, остаются важные вопросы. Ответы на них должны быть получены до того, как метод будет использован в практике. В частности пока неизвестно, насколько можно экстраполировать все данные на сетчатку человека, и в частности, насколько губительна длительная экспрессия Cas9 для клеток сетчатки млекопитающих и человека.

Существуют также попытки создания в лаборатории функционирующей сетчатки человека. Первыми такими шагами было получение из iPSCs человека морфологически зрелых фоторецепторов, имеющих все атрибуты функциональной специализации – внутренний и наружный сегменты фоторецепторной клетки. Вслед за этим была поставлена задача формирования из таких клеток тканевого продукта, где фоторецепторные клетки находились бы в нужной ориентации и отвечали бы на обработку светом. Maria-Valerio Canto-Soler (директор исследовательского центра ретинальной дегенерации в университете Johns Hopkins) и коллеги показали возможность дальнейшего роста и дифференцировки фоторецепторов, полученных из iPSCs человека, с последующим формированием ткани, содержащей клетки, не только в нужном соотношении и ориентации, но и обладающих функцией (X. Zhong et al. 2014; рис. 1). Формирующаяся ткань, высаженная в чашки на специальный матригель и в среду, обеспечивающую нейральную дифференцировку, имела определенную, сходную с онтогенетичекой у человека, динамику развития и поддерживалась in vitro в течение 200 дней. Аналог фрагмента сетчатки содержал семь клеточных типов, включая четыре типа фоторецепторов, обладающих наружным и внутренним светочувствительными сегментами – проводниками светового потока. Эти клетки содержали зрительные пигменты опсины – трансмембранные белки, ответственные за передачу сигнала от захваченных фотонов света в физиологический ответ, который регистрировали с помощью электродов. В этой истории удивляет автономный механизм выхода клеток искусственно выращенной сетчатки в дифференцировку, т.е. с большой вероятностью наличие неких, пока не известных, внутренних инструкций в отсутствие сопровождающих развитие сетчатки других тканей глаза.

Эта работа является определенным достижением, поскольку до сих пор не удавалось вывести получаемые клетки в столь глубокую, физиологически близкую полноценной, дифференцировку. Авторы работы при этом предупреждают, что еще необходимо значительное время до момента, когда такие клеточные продукты смогут быть использованы в клинической практике.

В другой работе, опубликованной в New England Journal of Medicine (Kuriyan et al., 2017) описана неудача попыток трансплантации стволовых клеток трем пациентам, пожилым женщинам, страдающим макулярной дистрофией сетчатки (AMD). Адипозитные клетки (клетки жировой ткани), взятые у пациентов, использовали для получения стволовых клеток, при этом они не были до конца проверены на свойства и возможную патогенность. Трансплантация таких клеток пациентам с AMD привела к серьезным осложнениям и потере зрения во всех трех случаях. В статье отмечается также, что данный случай только вершина айсберга, поскольку известно, что сходным образом трансплантации непроверенного клеточного материала осуществляются в 600 клиниках США. В противоположность данной неудаче в том же журнале New England Journal of Medicine сообщается о благополучных исходах при трансплантации пласта ретинального пигментного эпителия, полученного из iPSCs клеток, с целью лечения AMD у пожилых пациентов. Результат невелик – отсутствие дальнейшего ухудшения зрения в течение 1 года.

При всех попытках трансплантаций выращенных in vitro из iPSCs или других источников клеток, клеточных агрегатов или фрагментов ткани сетчатки самым трудным и наиважнейшим (поскольку речь идет о сенсорной ткани) является вопрос интеграции введенного материала в ткань реципиента и установление корректных взаимосвязей с другими клетками и зрительным анализатором. Работ, в которых делаются попытки решить эту проблему, или, по крайней мере, найти подходы к ее решению, очень немного. Ниже мы приводим одну из них (Blackiston et al., 2017).

Авторы проделали достаточно необычные эксперименты на личинках лягушки X. laevis, у которых глаза полностью развиваются к 47 стадии. До этого момента на 34 стадии зачатки глаз, а точнее области их формирования, были удалены, что приводило к слепоте личинок, служивших для трнасплантации развивающихся глаз (взятых на 24 стадии) в область хвоста (рис. 3). В сайте трансплантации глаза продолжали развиваться, имели проксимо-дистальную ориентацию и хрусталик, обращенный наружу. Вокруг таких глаз на более поздних стадиях формировалась очень незначительная по объему иннервация. В случае обработки пересаживаемого зачатка глаз агонистом серотониновых рецепторов 5-HT1B/D золмитриптаном (Zolmitriptan) морфология эктопического глаза не изменялась, но значительно возрастала сеть афферентных волокон. В росте нейритов участвовали также ткани хвоста и тела головастика. Возросшая иннервация в ответ на обработку нейротрансмиттером и активацию рецепторов серотонина 5-HT1B/D приводили к увеличению функциональной интеграции эктопического органа в цнс реципиета и, как полагают авторы, включение этой новообразованной нейральной сети в его поведенческую исходную программу.

Особенностью работы явилось то, что используемый агент, агонист 5-HT1B/D золмитриптан известен, как серотонинергическое медикаментозное средство, широко используемое человеком. Вторая особенность – тщательно разработанные физиологические тесты, доказывающие появление светочувствительности у слепых головастиков в результате проведенной трансплантации эктопического развивающегося глаза, его обработки золмитриптаном, роста нейральных волокон и их взаимодействия с нервной тканью реципиента.

Остается вопрос, в какой степени мозг реципиента корректно интерпретирует поступающие от подсаженного глаза сигналы, и будет ли работать данная схема взаимодействий во взрослом организме (в случае лягушки после метаморфоза). Несмотря на неординарность подобного подхода и, наоборот, консервативность других в решении вопроса интеграции различного рода клеточных продуктов, тканей и органов при трансплантации, можно, вероятно, заключить, что в эксперименте все средства хороши, но поспешность в трансляции в медицину может быть в лучшем случае неэффективной, а в худшем губительной.

Новость подготовила © 2017 Григорян Э.Н.

17.04.2017