Волосяные фолликулы (ВФ) являются производными кожи, участвующими в ее развитии и гомеостазе. Среди производных кожи, которые могут быть получены в лабораторных условиях, в рамках получения ВФ достигли наилучших результатов. У млекопитающих ВФ отвечают за формирование, рост и развитие стержней волоса, которые, в свою очередь, обеспечивают терморегуляцию, сенсорную информацию, защиту от внешних воздействий и важны для социальной коммуникации [1; 2]. Клетки дермальной папиллы (DPCs) расположены в основании ВФ, где они контролируют развитие и цикл ВФ и участвуют в поддержании его гомеостаза [3].

Происхождение DPCs в эмбриогенезе человека различается в зависимости от района кожи, в котором они формируются. Краниальные и лицевые DPCs в составе ВФ происходят из клеток нервного гребня, а дорсальные и вентральные DPCs развиваются из дермомиотома сомитов и боковых пластинок [4]. Однако из-за биоэтических ограничений процесс дифференцировки клеток нервного гребня в DPCs, а также промежуточные этапы дифференцировки в морфогенезе кожи человека изучены недостаточно хорошо [4].

Важным инструментом в современной биологии развития, регенеративной медицине и моделировании генетических заболеваний являются индуцированные плюрипотентные клетки человека (hiPSCs) [5, 6]. На сегодняшний день разработано несколько протоколов, позволяющих напрямую дифференцировать hiPSCs в DPCs [7; 8]. В недавних исследованиях также сообщалось о получении аутологичных двухкомпонентных живых эквивалентов кожи (ЖЭК) из полученных из hiPSC фибробластов и кератиноцитов [9; 10]. Кроме того, при помощи DPCs и кератиноцитов можно создавать модели эпителиально-мезенхимных взаимодействия между кератиноцитами и клетками ДП в органогенезе кожи (11). Нашими главными задачами было получение клеток DPCs из hiPSCs и исследование их потенциала в качестве дермального эквивалента в ЖЭК, поскольку ДП участвуют в регенерации волосяных фолликулов и развитии кожи, а также стабильно пролиферируют в культуре и анализ траектории дифференцировки hiPSCs-NPCs в hiPSCs-DPCs.

В ходе нашего исследования мы получили DP-подобные клетки из hiPSCs при помощи двухстадийной дифференцировки hiPSCs. На первой стадии при помощи двойного SMAD- ингибирования были получены нейтральные стволовые прогениторные клетки (hiPSC-NPCs). На второй стадии hiPSC-NPCs дифференцировали в клетки дермальной папиллы (hiPSCs-DPCs) и верифицировали их фенотип при помощи иммуноцитохимического выявления маркеров и ПЦР в реальном времени.

В результате на основе высокого уровня экспрессии гладкомышечного актина, версикана, виментина, фибронектина, S100A4, Cd133 и пониженного уровня экспрессии Sox2, нестина, nanog и β-III-тубулина у полученной в ходе дифференцировки клеточной линии был подтвержден целевой фибробластоподобный фенотип (рис. 1С;D;E). Также необходимо отметить изменение морфологии в ходе дифференцировки. На финальной стадии клетки приобрели характерный для клеток DP веретеновидный фенотип с относительно недлинными отростками и большим ядерно- цитоплазматическим отношением (рис. 1А).

Рис. 1. Морфология и экспрессия маркеров hiPSC-DPCs.
A. Схема дифференцировки hiPSCs в hiPSC-DPCs.
B. HIPSCS на разных стадиях дифференцировки в ДП-подобные клетки. 1A: фазовый контраст. Масштабная линейка: 200 мкм на левом и правом изображениях и 400 мкм в центре.
C. Иммунофлуоресцентное определение маркеров ДПК (версикан, αSMA, S100A4, фибронектин и виментин) в hiPSC-NPCs (отрицательный контроль), hiPSC-DPCs (экспериментальная группа) и hDPCs (положительный контроль). Масштабная линейка: 100 и 200 мкм. Ниже: Интенсивность флуоресценции версикана, αSMA, S100A4, фибронектина и виментина в hiPSC-NPCs, hiPSC-DPCs и hDPCs. Шкала - относительная величина; *p ≤ 0,05; ns - не значимо; p ≥ 0,05, тест Манна-Уитни.
D. Уровни экспрессии маркеров плюрипотентности (Sox2, Nanog) и NPC (Sox2, Nestin, β-тубулин III) в hiPSCs (отрицательный контроль 1), hiPSC-NPCs (отрицательный контроль 2), hiPSC-DPCs (экспериментальная группа) и hDPCs (положительный контроль), полученные методом qPCR. *p ≤ 0,05; ns - non significane; p ≥ 0,05, Mann-Whitney test.
E. Уровни экспрессии маркеров фибробластов - фибронектина, виментина, версикана, αSMA и CD133 - в hiPSCs (отрицательный контроль 1), hiPSC-NPCs (отрицательный контроль 2), hiPSC-DPCs (экспериментальная группа) и hDPCs (положительный контроль) с помощью qPCR. *p ≤ 0,05; ns - non significane; p ≥ 0,05, Mann-Whitney test.

Также целевой фенотип полученной клеточной линии был подтвержден в ходе ряда функциональных тестов на эпителиально-мезенхимные взаимодействия с кератиноцитами человека: формирование двухслойного ЖЭК; формирование сфероидов, имитирующих ранние стадии фолликулогенеза; тест на тубулогенез. Все тесты дали положительный результат. С результатами этих тестов можно ознакомиться в полном тексте статьи.

Для того, чтобы изучить дифферон клеток нервного гребня в эмбриогенезе, мы проанализировали траекторию дифференцировки hiPSC-NPCs в 4 временных точках (W_2 – 2 недели дифференцировки; W_4 – 4 недели дифференцировки; W_6 – 6 недель дифференцировки; W_8 – 8 недель дифференцировки) при помощи Bulk RNA-секвенирования. Данная модель является относительной репрезентативной, поскольку NPCs являются близкими аналогами клеток нервного гребня. В ходе этого анализа мы сумели подтвердить формирование субпопуляции клеток, близких к нейрально-мезенхимным бипотентным прогениторным клеткам, описанным Солдатовым и др. в 2019 (рис. 2А). Сходство W_2 с бипотентными прогениторами подтверждалось повышением экспрессии TWIST1, PRRX2, PRRX1 и PHOX2B (рис. 2Е). Снижение экспрессии маркеров вегетативных нейронов (ASCL1 и PHOX2B) и повышение экспрессии глиальных (EGFLAN, MSTN, GFAP) и мезенхимальных (TWIST1, PRRX1, FLI1, SIX2, FOXC1) маркеров на W_4-W_8 свидетельствует о том, что нейрально-мезенхимных предшественники дифференцируются в глиальные и мезенхимных клетки после второй недели дифференцировки (рис. 2Е). Эти изменения также коррелировали с морфологическими изменениями и образованием нейронов в W_2, которые не наблюдались в W_4. Терминальный фенотип hiPSC-DPCs был сходен с таковым у hDPCs (рис. 2D). Примечательно, что все вегетативные глиальные маркеры экспрессировались как в hDPCs, так и в клетках W_8 (рис. 2E). Возможно, что некоторые глиальные субпопуляции сохраняются в эмбриональной и взрослой нише ДП. Паттерны экспрессиии генов hDPCs (CD44, APCDD1L, VCAM, ACTA2, MFAP5) в hiPSCs-DPCs, а также сходные уровни экспрессии генов бипотентных прогениторов между hiPSC-DPCs и положительным контролем (hDPCs) могут быть интерпретированы как формирование субпопуляции ДП-подобных клеток на стадиях дифференцировки W_6 и W_8 (рис. 2E).

Для лучшего понимания фенотипической пластичности DP-подобных клеток в процессе дифференцировки и верификации результирующей клеточной линии был проведен анализ экспрессии генов нейронов, фибробластов, эмбриональных и зрелых DPCs. Анализ показал, что в hiPSC-NPCs (отрицательный контроль) по сравнению с клетками W_8 происходит снижение экспрессии нейральных генов (PAX6, TUBB3, NESTIN, GLDC, SOX2, MAP2, SLC2A4) и повышение экспрессии генов фибробластов (VCAN, FN1, S100A4, CD44 и др.) (рис. 2E и 2F). Примечательно, что большинство генов, экспрессирующихся в эмбриональных и зрелых DPCs (BMP4, BMP7, WNT5A, MEGF11, LPL, COL23A1, BAMB1 и EDN3), достигали максимального уровня экспрессии в клетках W_2 (рис. 2F). Изменения в экспрессии генов коррелировали с наблюдаемым преобразованием морфологии (рис. 2D). Кроме того, по временным изменениям экспрессии генов клетки W_2 отличались от контрольной и остальных экспериментальных групп, а клетки W_4, W_6 и W_8 были в основном идентичны и более схожи с клетками положительного контроля (hDPCs), чем клетки W_2 (рис. 2В и 2С). Таким образом, данный анализ демонстрирует сходство между развитием нервного гребня мыши (для дифферона которого и были определены ключевые маркеры, экспрессия которых анализировалась в данной работе) и дифференцировкой in vitro нервного гребня человека в DP-подобные клетки. Паттерн экспрессии ключевых маркеров в DP-подобных клетках (W_8) сходен с таковым в hDPCs, но не идентичен.

Рис. 2. Анализ данных РНК-секвенирования объемных hiPSC-DPC в нескольких временных точках дифференцировки.
A. Схема, показывающая траекторию дифференцировки клеток нервного, которые являются предшественниками DPCs, в ходе эмбриогенеза мыши [18].
B. Тепловая карта иерархической кластеризации матрицы евклидовых расстояний значений log2(CPM) для всех образцов (NPCs 1-3 [отрицательный контроль], hiPSC-DPCs после 2, 4, 6 и 8 недель дифференцировки и DPCs 1-3 [положительный контроль]).
C. Многомерное шкалирование, показывающее вариабельность между репликами и различными методами лечения по log2 fold change (log2FC) расстояния (log2FC 500 лучших генов).
D. Фазово-контрастные изображения, демонстрирующие изменение морфологии клеток в процессе дифференцировки hiPSC. Масштабная линейка: 200 мкм (левое и правое изображения); 400 мкм (центр).
E. Точечные диаграммы для отдельных групп генов, отражающие профили экспрессии генов NPCs, бипотентных предшественников, вегетативных нейронов, вегетативной глии, мезенхимальных стволовых клеток, происходящих от нервного гребня, и маркеров DPCs. Точками показаны фактические значения экспрессии для каждого образца. Линии: значения, найденные с помощью GLM; *специфические маркеры для несмещенной кластеризации; **некоторые неспецифические маркеры фибробластов с высокой экспрессией в hDPCs.
F. Тепловая карта, иллюстрирующая экспрессию дифференциально экспрессирующихся генов на основе RNA-seq сравнения между NPCs 1-3 (отрицательный контроль), hiPSC-DPCs после 2, 4, 6 и 8 недель дифференцировки и hDPCs 1-3 (положительный контроль). В столбцах указаны образцы, а в строках - гены с повышенной (красный цвет) и пониженной (синий цвет) экспрессией.

Для дальнейшей оптимизации протокола дифференцировки и анализа эпителиально- мезенхимальных взаимодействий мы оценили динамику экспрессии нейрональных и специализированных маркеров в DP-подобных клетках в процессе дифференцировки. Другой задачей было выявление стадии дифференцировки, наиболее чувствительной к взаимодействию с кератиноцитами. Для этого было разработана модель, состоящая из двух частей. В первой группе клетки дифференцировали в соответствии с нашим стандартным протоколом. Во втором - клетки дифференцировались в системе с мембранными вставками вместе с кератиноцитами человека в течение 4 дней (рис. 3А). Затем мы использовали иммуноцитохимический анализ для оценки экспрессии маркеров пролиферации (KI67), нейральных (β-3-тубулин, GFAP) и дермальных клеток (версикан, α-SMA и виментин) в контроле и в условиях совместного культивирования на стадиях W_2; W_4; W_6и W_8. Экспрессия GFAP, глиального маркера, и β-3-тубулина, маркера незрелых нейронов, была обнаружена только в отрицательном контроле и в W_2 как в контроле, так и в условиях совместного культивирования, за исключением положительной экспрессии β-3- тубулина на 56-й дне дифференцировки. При совместном культивировании DP-подобных клеток с кератиноцитами человека нейральная дифференцировка подавлялась, а количество β-3-тубулин+ клеток было значительно ниже, чем в контроле. (рис. 3В; рис. S6). Однако, без сокультивирования, hiPSC-NPCs и hiPSC-DPCs через 2 недели дифференцировки были способны образовывать нейроны, экспрессирующие β-3-тубулин (рис. 3В). Кроме того, экспрессия гладкомышечного актина через 14 и 28 дней дифференцировки и версикана через 14 дней дифференцировки была значительно выше в условиях сокультивирования с кератиноцитами по сравнению с контролем (рис. 3В; рис. S6). Динамика экспрессии всех дермальных маркеров изменялась в одинаковой степени, за исключением более высокой экспрессии версикана, наблюдавшейся через 6 недель дифференцировки в контроле по сравнению с условиями сокультивирования. Других существенных различий, основанных на иммуногистохимии, не наблюдалось (рис. 3В; рис. S6).

Рис. 3. Влияние совместного культивирования на hiPSC-DPCs и первичные кератиноциты человека.
А. Схема дифференцировки hiPSCs в DPCs при сокультивировании.
B. Иммуногистохимическое определение с помощью флуоресцентной микроскопии α-SMA, β-3-тубулина, GFAP, версикана и виментина в одних hiPSC-DPC (обведено зеленой рамкой) и в условиях сокультивирования с кератиноцитами (обведено оранжевой рамкой). Масштабная линейка: 200 мкм.
C. Доля пролиферирующих клеток при дифференцировке в DPCs в контроле и при совместном культивировании с кератиноцитами в течение 4 дней. *статистически значимая разница; p < 0,05.
D. Доля пролиферирующих кератиноцитов (Ki67+) в контроле и при совместном культивировании с дифференцирующимися hiPSC-DPCs. * статистически значимая разница; p < 0,05; ns - non significane; p ≥ 0,05.

Если обобщить все полученные результаты, можно утверждать, что разработанный нами протокол дермальной дифференцировки hiPSC-NPC позволил получить клеточную линию с характеристиками молодых фибробластов, экспрессирующих маркеры DPCs и индуцирующих ранние стадии фолликулогенеза in vitro. Полученные hiPSC-DPC взаимодействовали с кератиноцитами при формировании органоидов в ЖЭК, инициировали тубулогенез и интегрировались в органоиды в культурах висячей капли, повторяя ранние стадии фолликулогенеза. Кроме того, в клетках W_6 и W_8 наблюдалась экспрессия маркеров фетальных и взрослых DPCs. Также новой информацией является тот факт, что hiPSC-NPC дифференцировались в DP-подобные клетки через промежуточный тип клеток, который был похож на бипотентный нейрально-мезенхимальный прогенитор, наблюдаемый при развитии нервного гребня мыши. В заключение необходимо отметить, что нами были получены библиотеки RNA-seq на 5 различных точках дифференцировки. Эти данные могут быть в дальнейшем использованы для изучения механизмов и сигнальных путей, лежащих в основе дифференцировки клеток нервного гребня.

Список использованной литературы:

Новость подготовил
© А.Рябинин
16.10.2023