Воспаление хитрой косточки? Если мозг состоит из нейронов как скелет из косточек, то старинное народное выражение созвучно последним результатам изучения мозга. Недавняя работа (Jovasevic et al., 2024) предполагает, что в основе механизмов некоторых видов памяти лежит воспалительная реакция определенных нейронов, вызванная фрагментацией их собственной ДНК.

Сразу отметим, что эта работа не является продолжением исследований, показавших необходимость двухцепочечных разрывов ДНК в промотерных областях ранних генов, участвующих в обучении, для активации их экспрессии (Madabhushi, R. et al. 2015, Activity-induced DNA breaks govern the expression of neuronal early-response genes. Cell 161, 1592–1605). Более того, существенный раздел статьи посвящен размежеванию с этими исследованиями. Авторы претендуют на открытие нового явления, нового механизма долговременной памяти, который, впрочем, также, как и ранние этапы обучения, сопровождается множественными разрывами ДНК в нейронах. Здесь повреждения ДНК выявлены на более поздних временных стадиях и в других областях генома.

Исходно исследование планировалось как рутинное изучение изменений транскриптома нейронов области СА1 гиппокампа мышей при формировании памяти о неприятном воздействии в определенном пространственном окружении. Это классический contextual fear conditioning, широко используемый для изучения контекст-зависимой памяти. Предполагалось, что знание об изменение экспрессии генов в нейронах СА1 подскажет, как формируются энграммы памяти.

Энграмма – это небольшой ансамбль нейронов, который формируется при обучении и в дальнейшем характеризуется связанной активностью входящих в него нейронов. К числу возможных механизмов формирования энграмм относят не только усиление синаптических взаимодействий между нейронами (долговременную потенциацию), но и изменение общего межклеточного пространства, объединяющего эти нейроны. Предполагается, что перинейрональные матриксные сети ослабляют тормозное влияние ГАМК-ергических нейронов на нейроны энграммы, обеспечивая тем самым их более высокий уровень возбуждения по сравнению с нейронами, не входящими в состав энграммы. Эти выводы сделаны на основе того, что подавление синтеза коллагена нарушает проявление долговременной памяти, но антагонист ГАМК пикротоксин на этом фоне демаскирует энграмму (Gogolla, et al., 2009, Perineuronal nets protect fear memories from erasure. Science 325, 1258–1261).

Ранее группа Jovasevic с соавторами, изучая изменения транскриптома в нейронах СА1 на 21 день формирования памяти, выявила повышение экспрессии генов внеклеточного матрикса и ресничек, необходимых для поддержания перинейрональных сетей (Jovasevic, V. et al. Primary cilia are required for the persistence of memory and stabilization of perineuronal nets. iScience 24, 102617 (2021). Хорошо исследованными в плане транскриптомного анализа оказались и ранние этапы (24-48 часов) формирования энграмм в дорсальном гиппокампе, для которых характерна экспрессия ранних генов (IEG), белков сигнальной трансдукции и чуть более поздняя экспрессия факторов роста (Rao-Ruiz, P. et al. 2019, Engram-specific transcriptome profiling of contextual memory consolidation. Nat. Commun. 10, 2232). В обсуждаемой работе исследовали еще один критический период консолидации памяти - 96 часов после обучения животного. Неожиданно оказалось, что на этом этапе дифференциально экспрессируются гены иммунного ответа, участвующие в распознавании нуклеиновых кислот. Среди генов иммунного ответа наиболее значимые изменения касались белка TLR9 и его последующего сигнального пути, опосредуемого NF-κB18. На первый взгляд такой результат смахивал на нонсенс биоинформатического анализа.

TLR9 – это Толл-подобный рецептор — мембранный белок, обеспечивающий функционирование врождённого иммунитета. TLR9 экспрессируется преимущественно в клетках иммунной системы, он распознаёт CpG-участки на молекуле ДНК, которые встречаются относительно редко в ДНК позвоночных по сравнению с бактериальной или вирусной ДНК. TLR9 - NF-κB18 каскад активируется при бактериальной или вирусной инфекции, апоптозе или клеточном стрессе, сопровождающимся появлением фрагментов митохондриальной ДНК в цитоплазме (например, Maatouk, L. et al. 2018, Nat. Commun. 9, 2450). Никакого очевидного отношения врожденный иммунитет, бактериальная ДНК и активация цитокинов к памяти, на первый взгляд, не имеют. Тем не менее, количественный ПЦР подтвердил повышение экспрессии гена TLR9 в нейронах СА1 через 96 часов после обучения. Повышено было и содержание белка TLR9, который оказался ко-локализован с маркером зрелых эндосом и лизосом LAMP2. Ко-локализация с маркером зрелых эндосом обнаруживалась существенно чаще, чем с маркерами ранних или разрушающихся эндосом, что предполагает активный транспорт TLR9 в готовые эндосомы, где происходит узнавание фрагментов ДНК и активируется NF-κB путь.

Следующий шаг исследования был достаточно очевиден: нужно было проверить, не детектируются ли фрагменты ДНК в цитоплазме нейронов после обучения. Уже было известно, что нейроны характеризуются интенсивным метаболизмом, который сопровождается образованием активных форм кислорода и повреждением ДНК, большей частью митохондриальной (Shadfar et al., 2023, Redox dysregulation as a driver for DNA damage and its relationship to neurodegenerative diseases, Transl. Neurodegener., 12, 18. doi: 10.1186/s40035-023-00350-4). Известен и другой, уже упоминавшийся путь, ведущий к повреждениям ДНК нейрона: это опосредованная возбуждением и кальций-нейрином активация топоизомеразы второго типа, осуществляющей двуцепочечный разрыв в промоуторах ранних генов и активацию их транскрипции с последующей репарацией места разрыва (Madabhushi, R. et al. 2015). Этот второй путь активируется в течение первых часов после обучения, через 24 часа большинство разрывов оказываются репарированными.

Иммуноцитохимический анализ выявил дискретные кластеры возбуждающих нейронов CA1 с множественными фрагментами двуцепочечной ДНК в цитоплазме и воспалительным фенотипом. Перинуклеарные сигналы γH2AX (гистоновая метка разрывов ДНК) локализовались совместно с TLR9. Количество разрывов значительно увеличилось через 1 час после обучения и сохранялось в несколько меньшем количестве ядер в течение 96-часового периода. (Эти данные не вполне согласуются с предыдущими работами, свидетельствовавшими о том, что вызванные обучением или новизной разрывы репарируются в течение первых суток (Suberbielle, E. et al. 2013, Physiologic brain activity causes DNA double-strand breaks in neurons, with exacerbation by amyloid-beta. Nat. Neurosci. 16, 613–621; Madabhushi, R. et al. 2015).

Совместное мечение γH2AX с белком ядерной оболочки ламином B1 показало, что во время максимального выявления двуцепочечных разрывов ДНК многие ядра характеризовались и разрывами ядерной оболочки. Предполагается, что эти разрывы могли привести к перинуклеарному выделению двухцепочечных фрагментов ДНК (dsDNA) совместно с гистонами γH2AX в областях эндоплазматического ретикулума. Предположение о переносе dsDNA и гистонов в эндолизосомы, а не их высвобождении в общий цитозоль, согласуется и с профилями экспрессии генов через 96 часов после обучения, которые в значительной степени связаны с функцией эндоплазматического ретикулума и транспортировкой везикул.

Персистирующие сигналы γH2AX, обнаруженные в более поздние временные точки (6–96 ч), имели диаметр 4 мкм и больше. Они ко-локализовались с маркерами центросомы центрином и γ-тубулином, демонстрируя перицентросомную локализацию, а не локализацию в местах разрывов dsDNA, как было обнаружено ранее на ранних этапах обучения (1-2 часа) (Madabhushi, R. et al. 2015). В отличие от небольших, резких и сфокусированных ядерных сигналов, все перицентросомные сигналы были большими и нечеткими. И еще одно важное наблюдение: они были ко-локализованы с белком 53BP1, основным медиатором репарации ДНК путем негомологичного соединения обрывов. Данные указывали на еще неизвестную для нейронов роль центросом в репарации ДНК. В делящихся клетках центросомная локализация 53BP1 уже была обнаружена, что согласуется и с растущим признанием роли центросом в клеточном ответе на повреждение ДНК (Yim et al., 2017, Plk1-mediated stabilization of 53BP1 through USP7 regulates centrosome positioning to maintain bipolarity. Oncogene 36, 966–978; Messina, et al., 2022, Evolutionary conserved relocation of chromatin remodeling complexes to the mitotic apparatus. BMC Biol. 20, 172). Участие центросом в поддержании целостности генов в делящихся клетках может оказаться значимым и для взрослых нейронов, претерпевающих геномные катаклизмы, вызванные пластичностью и формированием памяти.

Какие же фрагменты ДНК обнаруживаются через 96 часов в перинуклеарных зонах нейронов? Авторам удалось прочитать последовательности нуклеотидов в этих фрагментах (секвенировать их). К их удивлению, фрагменты не имели отношения к митохондриальной ДНК, следовательно они не были результатом окислительного стресса. Фрагменты не имели отношения к промоутерным участкам ранних генов, следовательно, это не продукты недорепарированных разрывов, связанных с их активацией на ранних этапах формирования памяти. Большинство из них относилось к некодирующим участкам геномной ДНК.

На этом линия исследования, связанная с происхождением фрагментов ДНК в цитоплазме обученных нейронов, обрывается. А продолжается другая – посвященная последствиям активации TLR9 этими фрагментами. И эта вторая линия, как мы увидим ниже, красиво «закругляет» исследование, возвращая его к исходным вопросам о формировании энграмм и перинейрональных сетей. Однако ощущение громадной непонятной черной дыры в самом центре работы остается. Что же такое происходит с нашей ДНК после обучения? Почему она крошится до такой степени, что запускает воспалительные процессы? Почему в этих фрагментах оказывается много CpG участков?

На эти вопросы пока ответа нет. Возможно, анализ транскриптома и метилома на еще одном временном интервале (между 48 и 96 часами) даст какие-нибудь наводки. А пока единственная зацепка - это обогащение обнаруженных фрагментов ДНК СpG последовательностями, которых мало в геноме позвоночных, но они указывают на возможные сайты деметилирования ДНК. Интересно, что возбуждение нейронов, и неспецифическое (при воздействии КCl), и опосредованное глутаматными рецепторами АМПА и НМДА типа, вызывает широкое деметилирование их генома (например, Grassi et al., 2017, Neuronal Activity, TGFβ-Signaling and Unpredictable Chronic Stress Modulate Transcription of Gadd45 Family Members and DNA Methylation in the Hippocampus, Cereb Cortex. V. 27. No. 8. P. 4166-4181. doi: 10.1093/cercor/bhx095). Деметилирование благоприятный процесс для мобилизации подвижных элементов генома. Могут ли обрывки некодирующей геномной ДНК быть связаны с активацией мобильных элементов, пока не ясно, но связь их появления с процессами деметилирования кажется очень вероятной.

Далее, опуская многие детали, перечислим основные результаты прозванивания цепочки от активации TLR9 до перинейрональных сетей. Авторы поставили несколько наивный вопрос: воспаление с последующей частичной репарацией ДНК - это побочный эффект или механизм формирования памяти? Они осуществили специфический нокдаун (выключение) TLR9 в нейронах гиппокампа. Это привело к ухудшению памяти и снижению экспрессии многих генов, активирующихся при консолидации памяти. А именно генов, связанных с функционированием центросомы, включая такие ее функции как репарация повреждений ДНК, формирование ресничек и образование перинейрональных сетей. Очевидно, что результаты были интерпретированы в пользу того, что воспаление - не побочный эффект, а сам механизм памяти. «Показан каскад молекулярных событий при обучении, приводящий к рекрутированию нейронов с повреждениями ДНК в процесс формирования памяти». Но что же происходит с нейронами, которые не включили воспалительные процессы в ответ на повреждение ДНК? При накоплении множественных повреждений их ждет апоптоз. Авторы подчеркивают «нарушение функции TLR9 может привести к геномной нестабильности, когнитивным нарушениям, связанным с ускоренным старением, психическими расстройствами и нейродегенеративными заболеваниями». Если это и механизм памяти, то основан он на попытке нейрона выжить. Либо он сможет частично репарировать повреждения и будет участвовать в энграммах, либо будет исключен из участия в энграмме и погибнет. Энграмма памяти как союз пострадавших, но выживших нейронов? Приходится признать, что обсуждаемые результаты с трудом вписываются в наши традиционные представления, разграничивающие механизмы явления и его побочные эффекты, а также выигрыш и плату («трейд-офф»). Интересный пример, демонстрирующий различие между естественно-научной логикой и подлинным устройством живого, которое в данном случае имеет более близкое сродство к парадоксальным художественным формулам, таким как «невыносимая легкость бытия» или «жизнь как смертельная болезнь» и т.п.

Новость подготовила
© В.Е.Дьяконова
16.08.2024