Изучение развития глаза и основных его структур - ретинального пигментного эпителия (РПЭ) и нейральной сетчатки (НС) ведется достаточно давно. Определенный вклад в понимание процесса внесен и сотрудниками ИБР РАН: различные аспекты развития глаза человека, от морфологических до молекулярно-биологических, решались и решаются Строевой О.Г., Пановой И.Г., Зиновьевой Р.Д., Александровой М.А., Маркитантовой Ю.В. и другими. Развитие современных технологий исследования на фоне базовых, накопленных различными коллективами сведений позволили в этом году осуществить эксперименты на уровне индивидуальных дифференцирующихся клеток РПЭ и НС у развивающихся плодов человека. Речь идет об использовании метода секвенирования ДНК отдельных клеток (single-cell RNA sequencing (RNA-seq)) в работе, проведенной в Китае большой группой исследователей (Hu et al., 2019). Данный метод наряду с биоинформационным анализом и иммунохимией впервые позволил вычленить транскриптомы индивидуальных клеток НС, последовательно дифференцирующихся в основные клеточные типы – фоторецепторы, интернейроны, ганглиозные клетки и клетки Мюллера, наряду со специализацией клеток РПЭ, происходящей в строгом соответствии с созреванием НС человека. Помимо существенной детализации и уточнений существующей информации это дало возможность приблизиться к пониманию функциональной роли экспрессии тех или иных генов в развитии двух важнейших тканей глаза. До сих пор это являлось «узким местом» на фоне стремительного накопления данных о работе тех или иных генов в сетчатке развивающихся позвоночных и человека.

Был известен ряд basic helix-loop-helix (bHLH) транскрипционных факторов (ТФ), и, в частности, те из них, что отвечают за мультипотентность ретинальных клеток предшественников: Pax6, Sox2, и Vsx2. Известно также, что по мере дифференцировки в работу включаются иные ТФ и в большем числе, ответственные за дифференцировку конкретных клеточных фенотипов. Atoh7 через активацию Pou4f2 и Isl1 приводит к дифференцировке ганглиозных клеток; Foxn4 через Neurod1, Neurod4, and Ptf1a обеспечивают судьбу амакриновых клеток; Rax2 и Otx2 ответственны за фоторецепторный фенотип, Vsx2 и Ascl1 за появление биполяров, а вот Мюллеровская глия возникает в результате сверхэкспрессии Hes1, Hes5, и Hey2.

Эта ранее полученная информация является базовой, однако пространственно-временные характеристики и динамика появления и начала функционирования того или иного клеточного типа получены теперь с помощью клеточного секвенирования, позволившего получить специфические клеточные «транскриптомные ландшафты». Авторы (Hu et al., 2019) применяли сетчатки, взятые на 5-24 неделе развития плодов человека (добровольная передача абортивного материала), клетки диссоциировали, выделяли РНК, а полученные от 2421 клеток транскриптомы относились как к ранним прогениторам, так и к РПЭ и основным клеточным типам НС в их развитии во временном порядке. В настоящее время все данные доступны на http://49.4.93.68:30004/. Полученные данные были кластеризованы в классы, соответствующие определенным клеточным типам, в свою очередь выявляемым на основе маркеров, определенных ранее и оказавшихся близкими для клеточных типов сетчатки мышей и человека.

В результате биоинформационного анализа были вычленены основные ТФ, проявляющие наиболее высокую активность в регуляторных сетях обеспечивающих дифференцировку раздельно РПЭ и НС. Обнаружено, что РПЭ и НС глаза человека довольно рано обладают различиями в сетях генетической экспрессии. Набор экспрессирующихся генов, специфичный для проспективной НС, был в высокой степени характерным для развития нервной системы, тогда как клетки РПЭ экспрессировали гены, связанные с метаболизмом ретинола.

Еще одним результатом работы на основе секвенирования изолированных клеток явилось уточнение времени появления тех или иных клеточных типов. Оказалось, что обладатели того или иного фенотипа в проспективной сетчатке по специфическому набору ТФ могут присутствовать много раньше известных ранее для них сроков, хотя и в незначительном числе, и только много позже достигать пика в количественном отношении. Например, отдельные ганглиозные клетки по профилю специфической экспрессии обнаруживаются уже на 5 неделе, но максимальная по численности их популяция формируется только на 8 неделе. Обнаружено также, что клетки – ранние прогениторы сетчатки экспрессируют гены, специфичные для палочек зрелой сетчатки, но не колбочек. Ожидаемым было выявление большего сходства по набору ТФ между клетками поздних плодов и взрослого человека по сравнению с ранними плодами. Интересным стало сравнение профилей экспрессии генов – маркеров фетальных клеток НС с таковыми взрослого человека. В некоторых случаях большинство из них присутствовало в обеих группах: например в биполярах сетчатки взрослого человека присутствовало 10 из 15 маркерных генов фетальных биполяров. Однако для ганглиозных клеток 30 топовых маркеров взрослых не обнаруживали высокой специфичности в тех же клетках плодов человека.

Сравнение проведено и с известными данными для сетчатки плодов макаки и мыши. Это позволило обнаружить большее сходство в транскриптомах фетальных клеточных типов сетчатки человека и мыши, чем человека и обезьяны.

Исследование транскриптомов клеток РПЭ в их последовательном развитии у человека обнаружило неуклонное падение экспрессии PAX6 и увеличение экспрессии генов зрительного цикла, таких как RPE65 and LRAT. При этом пролиферирующие клетки РПЭ обнаруживались на 5-6 неделе, а экспрессия родопсина на 24 неделе, хотя другие гены, ассоциированные со зрительным циклом, обладали экспрессией уже на 13 неделе развития.

Таким образом, определение клеток развивающейся сетчатки человека на основе их индивидуальных траскриптомов, давших информацию как об экспрессии ТФ, так и структурных белках, впервые позволило приблизиться к пониманию функциональной роли участников регуляции экспрессии генов в пространственно-временной их динамике. Немаловажным результатом рассматриваемой работы стало описание паттерна динамической экспрессии генов, как в РПЭ, так и в НС, ответственных за зрительный цикл и лиганд-рецепторные в нем взаимодействия.

В завершение, работа Hu et al (2019) имеет важное прикладное значение. Ее рузультаты позволяют наметить стратегию борьбы с рядом наследственных заболеваний сетчатки, «корни» которых находятся в особенностях генетической экспрессии и выявляемых еще в ранних прогениторах, фетальных клетках сетчатки, генов-мишеней, ассоциированных с наследуемыми болезнями сетчатки человека.

Новость подготовила © 2019 Григорян Э.Н.

16.08.2019