О стволовых клетках (СК) человечеству известно почти 100 лет, а первые эксперименты по практическому использованию человеческих стволовых клеток были начаты в начале 1950-х годов. В настоящее время исследователи сосредоточены наисследовании двух типов стволовых клеток: эмбриональных и постнатальные. Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) извлекаются из растущего зародыша, способны естественным образом дифференцироваться во все типы клеток организма. Это свойство называется плюрипотентностью. Однако этический аспект исследования и применения ЭСК вызывает серьезную полемику. Постнатальные стволовые клетки способны развиться только в ограниченное количество типов клеток, в основном в пределах одного зародышевого листка. Но воздействуя определенным образом, можно раскрыть их плюрипотентные свойства. Считается, что возможность клинического использования аутологичных стволовых клеток обеспечивает эффективность и безопасность лечения.

Несмотря на то, что лечение с помощью СК выглядит многообещающе в долгосрочной перспективе, ученые озабочены безопасностью процедур с введением стволовых клеток в организм человека. В процессе культивирования in vitro возможны генетические изменения СК, которые могут приводить к онкогенной трансформации после трансплантации.

В фармакологии при тестировании лекарственных средств спонтанные мутации СК in vitro могут исказить истинную реакцию лекарства и токсикологические измерения, что приведет к неправильной трактовке результатов исследований. Поэтому поддержание стабильности генома в культуре клеток in vitro является необходимым условием для успешного применения стволовых клеток.

Многочисленными исследованиями были выявлены повторяющиеся геномные изменения, которые обычно происходят в культивируемых постнатальных и эмбриональных СК человека. Однако анализ больших выборок имеет ограничения: в культуре выявляются только мутации, которые являются общими для большинства клеток. При этом мутационный механизм геномных изменений в процессе культивирования остается неясным.

Авторам удалось разработать точный метод систематического измерения мутационного воздействия культивирования in vitro на трех типах стволовых клеток: плюрипотентных стволовых клеток (ПСК), постнатальных СК печени и СК тонкого и толстого кишечника. Были созданы клоны для одной плюрипотентной линии ЭСК, двух линий клеток с индуцированной плюрипотентностью, двух линий СК печени и двух линий СК кишечника. Каждую клональную линию культивировали в течение 2 и 5 месяцев, накапливая мутации. Второй клональный этап позволил генерировать субклоны, которые использовались для определения мутаций отдельных клеток-родоначальников этих субклонов.

Клоны, субклоны и соответствующие референсные образцы исследовали методом полногеномного секвенирования (whole-genome sequencing) WGS. Данный метод обеспечивает точный анализ нуклеотидных последовательностей генома, позволяет идентифицировать мутации, которые не определяются стандартными методами (кариотипирование, микрочипы). Ранее авторы разработали метод точной идентификации приобретенных соматических мутаций in vivo в индивидуальных стволовых клетках путем комбинирования метода WSG и экспансии клонов, полученных из единичной СК in vitro. Таким образом варианты мутаций зародышевой линии и мутаций, накопленных до первого клонального этапа, были исключены из субклонов. Варианты мутаций, которые возникли in vitro после второго клонального этапа, были отфильтрованы биоинформатически. Такой метод позволил измерить те мутации, которые накопились именно в период культивирования между двумя клональными стадиями. Интересно, что кариотипы исследуемых клонов и субклонов оказались нормальными, без хромосомных аномалий.

Расчет частоты мутаций за время удвоения популяции авторы считают наиболее информативным, нежели число мутаций в единицу времени. Поскольку получение нужного (для терапии или исследования лекарств) числа стволовых клеток исчисляется количеством удвоения клеточной популяции, которое зависит от скорости деления и уровня гибели клеток. В данном исследовании время удвоения популяции ПСК человека составляет примерно 23 часа, а стволовых клеток печени и кишки – 46 ч и 44 ч соответственно.

Авторами было выявлено 4517 уникальных базовых замен в субклонах. Однако анализ мутаций вследствие делеций и инсерций нуклеотидов происходили в некодирующих участках генома. Было показано, что отдельные эмбриональные, кишечные и печеночные стволовые клетки накапливают 3,5 ± 0,5, 7,2 ± 1,1 и 8,3 ± 3,6 базовых замен соответственно, в результате удвоения клеточной популяции. Как видно из полученных данных, постнатальные стволовые клетки накапливают больше базовых замен, чем эмбриональные. В других исследованиях было показано, что ПСК имеют высокий уровень репарации ДНК, поэтому в ПСК низкий уровень повреждения ДНК. Математическое моделирование, приведенное авторами, показало, что в ПСК чаще происходит онкогенная мутация, чем во постнатальных стволовых клетках. При подсчетах учитывали скорость накопления мутаций, спектр мутаций, геномное распределение.

Таким образом, годовая скорость накопления мутаций in vitro у постнатальных стволовых клеток выше почти в 40 раз, чем скорость накопления мутаций in vivo. Однако не стоит забывать, что временной период in vivo в огромной популяции клеток исчисляется десятилетиями, тогда как in vitro достаточное для исследований количество клеток достигается за недели или месяцы.

Авторы показали, что основная причина накопления мутации in vitro - окислительный стресс, возникающий при культивировании. ПСК чувствительны к повреждению ДНК, связанному с культивированием в атмосфере 20% кислорода. В таких условиях происходит замена нуклеотидов С на Т во всех трех типах стволовых клеток. Культивирование в атмосфере 3% кислорода в течение 3 месяцев показало достоверное снижение однонуклеотидных замен при расчете на время удвоения популяции. Таким образом, культивирование стволовых клеток при пониженном кислородном напряжении снижает уровень активных форм кислорода и уменьшает частоту in vitro индуцированных мутаций.

Наиболее важный аспект при накоплении мутаций – затрагивают ли они онкогены. Авторы использовали эмпирически определенные специфические для СК мутации, мутационные спектры, геномное распределение, чтобы смоделировать подсчет риска возникновения онкогенных мутаций в процессе культивирования. Авторы выявили почти линейную корреляцию между совокупным числом патогенных мутаций в онкогенах и количеством культивируемых стволовых клеток in vitro. Так, было показано, что хотя бы одна онкогенная мутация присутствует в исследуемых популяциях, состоящих из 3,5 млн печеночных СК, 13 млн кишечных СК и 24 млн ПСК. Это указывает на то, что есть риск возникновения онкогенной мутации в любой стволовой клетке, особенно при указанной плотности популяции. Эти данные можно использовать для более точного подсчета рисков специфической онкогенной мутации, возникающей при культивировании in vitro разных типов стволовых клеток.

Интересен тот факт, что пониженное количество кислорода при культивировании, уменьшающее общую частоту мутаций, не уменьшало риск возникновения онкогенных мутаций.

Чтобы оценить генетические риски возникновения онкогенных мутаций во время культивирования in vitro, авторы статьи определили все мутации в отдельных стволовых клетках человека путем секвенирования генома и показали, что риск специфической онкогенной мутации довольно низкий.

Таким образом, стандартное культивирование in vitro оказывает большое влияние на скорость накопления мутаций. Однако только 2% мутаций выявлены в белок-кодирующих участках ДНК. При этом не были затронуты онкогены. Авторы также не выявили мутаций в промоторных и фланкирующих последовательностях генома исследуемых клеточных линий стволовых клеток. Это может свидетельствовать о том, что накопленные мутации не изменяют активность онкогенов и не влияют на развитие рака.

Лечение стволовыми клетками – заманчивая перспектива для медицины. Результаты данной работы показывают, что стандартные условия культивирования оказывают большое влияние на скорость накопления мутаций. Однако полученные в процессе культивирования мутационные паттерны СК явно отличаются друг от друга, что указывает на минимальный вклад мутаций, индуцированных клональными стадиями. Авторы уверены, что наблюдаемые in vitro мутации не будут препятствовать будущему использованию стволовых клеток в регенеративной медицине. Однако необходимо оптимизировать условия культивирования, в частности - минимизировать время культивирования и четко оценивать риски онкогенной трансформации после трансплантации стволовых клеток.

Новость подготовили © Дашенкова Н.О. © Абдыев В.К.
16.06.2020