Поддержание редокс-гомеостаза является критическим условием жизнеспособности и функций клеток. Высоко интенсивный метаболизм в клетках ретинального пигментного эпителия (РПЭ) и фоторецепторах сетчатки создает риск развития в них окислительного стресса (ОС). Важное место механизмах регуляции жизнедеятельности клеток принадлежит молекулярным шаперонам, таким как белки теплового шока (БТШ, HSPs) (Zhao et al., 2020). HSPs активируются в ответ на внутренние и внешние стрессоры (ОС, гипоксия, гипергликемия и др.), выступая в качестве центра адаптивного ответа (Balchin et al., 2020). В обзоре мы провели анализ текущего состояния исследований эндогенной системы защиты в РПЭ, с акцентом на аутофагию и HSPs, подчеркнув их значимость как потенциальных мишеней для терапии связанных с РПЭ дегенеративных патологий сетчатки.

Основные функции РПЭ. РПЭ обеспечивает барьерную функцию, постоянное обновление дисков наружных сегментов фоторецепторов за счет их фагоцитоза (Lakkaraju et al., 2020). Дефекты в процессе фагоцитоза приводят к нарушению функции сетчатки (Mazzoni et al., 2014). Ключевая физиологическая функция РПЭ связана с защитой фоторецепторов от избыточного света и активных форм кислорода (АФК) посредством эндогенных защитных систем. РПЭ поддерживает функции нейронов сетчатки и сосудистой оболочки глаза (George et al., 2021), благодаря скоординированному действия компонентов эндогенной системы защиты. Дисфункция клеток РПЭ связана с нарушениями ключевых компонентов эндогенной системы защиты РПЭ и способствует развитию заболеваний сетчатки, таких как возрастная макулярная дегенерация (ВМД), диабетическая ретинопатия (ДР), пролиферативная витреоретинопатия (ПВР) (Kim et al., 2021).

Ключевые эндогенные защитные системы РПЭ обеспечивают окислительно-восстановительный гомеостаз и антиоксидантную защиту клеток, способствуют восстановлению поврежденных белков или их деградации посредством аутофагии и убиквитин-протеасомной системы (Kaarniranta et al., 2019). Аутофагия это эволюционно консервативный механизм прижизненной утилизации (деградации с помощью лизосом) внутриклеточного материала, ненужных клеточных структур для поддержания клеточного гомеостаза, необходимый для запрограммированного выживания клеток. Процесс аутофагии играет важную роль в адаптации к стрессу, иммунных реакциях и регуляции воспалительных процессов. Эндогенные защитные системы клеток РПЭ включают систему шаперонов, связывающую антиоксидантную систему (АОС) и различные формы аутофагии (Рисунок 1). В АОС входят ферменты супероксиддисмутазу (СОД), каталазу, цитохром P450 монооксигеназа), неферментативные молекулы (тиоредоксин, глутатион-аскорбат и β-каротин). В РПЭ ключевыми компонентами АОС являются меланосомы и меланин, которые выполняют функции экранирующих светофильтров (Dontsov et al., 2024). Меланин снижает фотоокисление липофусцина (ЛФ), защищая РПЭ от вредного воздействия яркого света, удаляет избыток АФК, тем самым защищая клетки от ОС (Hu et al., 2008).

Рисунок 1. Эндогенная система защиты, поддерживающая редокс-гомеостаз клеток РПЭ. Сокращения: TJ – плотные контакты; BM – мембрана Бруха; Ch – хориоидея; PR – фоторецепторы; R – палочки; C – колбочки; ER – эндоплазматический ретикулум; Mt – митохондрии; L – лизосомы; POS – наружные сегменты фоторецепторов; ROS – активные формы кислорода.

Основные межклеточные и молекулярные события, способствующие окислительному повреждению клеток РПЭ. В клетках сетчатки АФК продуцируются лизосомами (фагосомами), пероксисомами, меланосомами и внутриклеточными мембраносвязанными НАДФН-оксидазами (Kaemmerer et al., 2007; Markitantova, Simirskii, 2020). Разрушительное влияние АФК проявляется в окислении белков и мембранных липидов, повреждении ДНК (Sies et al., 2017). В условиях ОС митохондрии усиливают продукцию АФК, что может привести к апоптозу клеток (Kaarniranta et al., 2019). Слабо окисленные формы белков подвергаются разрушению лизосомами, и могут служить субстратами для протеасом. Высоко окисленные белки, вероятно, образуют стабильные агрегаты с окисленными липидами, образуя гранулы ЛФ. Избыточное накопление агрегированных белков способствует стрессу эндоплазматического ретикулума (ЭР), увеличивает ОС, что приводит к повреждению лизосом и воспалению (Zhang et al., 2014). Процесс образования ЛФ в РПЭ сопровождается ингибированием активности протеасом в РПЭ и снижением интенсивности аутофагии (Lakkaraju et al., 2007). В свою очередь, нарушение лизосомальной деградации, вызвано избыточным накоплением ЛФ (Brandstetter et al., 2016). Структурно-метаболические и генетические нарушения клеток РПЭ и соседних тканевых структур (сосудистой оболочки, мембраны Бруха, фоторецепторов) приводят к накоплению токсичных компонентов, что создает риск нарушения окислительно-восстановительного баланса (Godley et al., 2005). Окислительно-восстановительное равновесие в клетках РПЭ во многом зависит от аутофагического клиренса, который является основой защиты от окислительного повреждения и от накопления дефектных белков (Mitter et al., 2012). В условиях ОС, воспаления и гипоксии в клетках РПЭ происходит нарушение регуляции между процессами образования аутофагосом и деградацией их содержимого в лизосомах.

Система защиты шаперонов, белков теплового шока в РПЭ. Белки теплового шока (БТШ) являются наиболее распространённой и изученной группой шаперонов. Клетки конститутивно экспрессируют многие типы БТШ. Они подразделяются на несколько семейств, в зависимости от их молекулярного размера, структуры и функций: малые БТШ (HSPB), HSP40 (DNAJ), HSP60/HSP10 (HSPD/E), HSP70 (HSPA), HSP90 (HSPC) и HSP100/110 (HSPH) (Kampinga et al., 2009). HSPs выполняют широкий спектр функций, участвуют в поддержании клеточного гомеостаза, дифференцировке (Szyller et al., 2021), стабилизации клеточных структур, фолдинге вновь синтезированных пептидов в зрелую форму белка, ре-фолдинге неправильно свернутых белков (Amirkavei et al., 2022), транспорте белков в субклеточные компартменты (Penke et al., 2018). ОС в РПЭ вызывает активацию редокс-зависимых антиоксидантов, шаперонов DJ-1 и альфа-1-микроглобулина. Последний может напрямую связывать и нейтрализовать АФК (Bergwik et al., 2021). αA-кристаллин через сигнальный путь PI3K/Akt обеспечивает устойчивость клеток РПЭ к действию ОС. αB-кристаллин регулирует экспрессию Atg7, медиатора биогенеза аутофагосом (Pattison, Robbins, 2011). αB-кристаллин защищает белки от агрегации и конформационных изменений, а также стимулирует продукцию фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), в ответ на воспаление. Hsp110 и Hsp70 выполняют функции цитопротекторов. HSP110 участвует в протеолизе α-синуклеина и/или предотвращении связанной с ним нейродегенерации (Polier et al., 2008). HSP90 необходим для восстановления функций неправильно свёрнутых и денатурированных белков, транспорта дефектных белков для протеолитической деградации (Prodromou, 2016). HSP27 взаимодействует с актиновыми филаментами, участвует в программируемой клеточной смерти (апоптозе) и важен для выживания клеток в условиях стресса (Zou et al., 2023). Схематичное изображение путей деградации в клетках РПЭ и участие БТШ в фагоцитозе, разных типах аутофагии и клеточной гибели представлено на рисунке 2.

Рисунок 2. Пути деградации в клетках РПЭ и связанные с ними процессы обозначены стрелками с соответствующими цветами: типы фагоцитоза (зеленый), типы аутофагии (синий) и формы клеточной смерти (красный). Сокращения: RPE – ретинальный пигментный эпителий; ROS – активные формы кислорода; ER – эндоплазматический ретикулум; LMP – пермеабилизация мембраны лизосом; LAP – LC3-ассоциированный фагоцитоз; HSPs – белки теплового шока

Система аутофагии и протеолиза. В клетках эукариот хорошо скоординированные системы отвечают за деградацию дефектных или избыточных белков: (1) убиквитин-протеасомная система (UPS), которая расщепляет большинство нормальных и аномальных внутриклеточных белков; (2) митохондриальные протеазы, которые расщепляют митохондриальные белки; (3) кальций-активируемые кальпаины и некоторые мембрана-ассоциированные ферменты, которые расщепляют белки цитоскелета и мембранные белки; (4) лизосомальная аутофагия, с помощью которой расщепляются клеточные органеллы, мембранные белки и эндоцитозные белки. Эти системы контролируют качество митохондрий и продукцию АФК в условиях нормального функционирования и обеспечивают антиоксидантную защиту клеток РПЭ в условиях ОС (Klaips et al., 2018).

Фагоцитоз. В клетках РПЭ кристаллин CRYBA1/βA3/A1 находится в лизосомах, где он влияет на активность V-АТФазы лизосом, взаимодействие которых с mTORC1 необходимо для регуляции аутофагии (Valapala et al., 2014). Шаперонин-содержащий комплекс TCP-1 (CCT), необходим для эффективной сборки актиновых миофиламентов. Связывание АТФ, с субъединицей CCT5 необходимо для эффективного сворачивания белков актина, биогенеза лизосом через актиновый цитоскелет. Шаперон Mesdc2 локализованный в ЭР облегчает сворачивание белков, связанных с рецепторами липопротеинов низкой плотности (LRP). Mesd может высвобождаться при слущивании фрагментов НСФ и стимулировать их фагоцитоз путем связывания клеток РПЭ с фагосомами (Chen et al., 2016).

LC3-ассоциированный фагоцитоз. В РПЭ описан тип фагоцитоза наружных сегментов фоторецепторов (гетерофагия), ассоциированный с микротрубочками белка 1 LC3B и макроаутофагией. Этот гибридный путь деградации фагоцитированных фрагментов НСФ, сочетающий аутофагию и фагоцитоз, называется фагоцитозом, ассоциированным с LC3 (LAP) (Frost et al., 2015). Процесс происходит с формированием аутофагосом, и включает фазы инициации и элонгации, во время которых формируется изолирующая мембрана аутофагосомы. Дальше происходит слияние аутофагосомы с лизосомами, во время фазы деградации захваченного материала. Все этапы процесса, от инициации до формирования аутофагосомы и её слияния с лизосомой, регулируются белками семейства ATG, участвующими в процессе аутофагии (Ktistakis et al., 2016). LAP поддерживает метаболизм ретиноидов и зрительный цикл, регулирует липидный гомеостаз и синтез противовоспалительных липидов (Dhingra et al., 2018). В этом процессе принимают участие специфические адаптерные белки, которые связывают LC3 и направляют материал, подлежащий деградации, в лизосомы. Одним из таких белков является меланорегулин, специфичный для фагосом. LAP и макроаутофагия зависят от липидизации LC3 до LC3II, что обеспечивает его мембранную связь с двух мембранными аутофагосомами при аутофагии, или одно мембранными фагосомами при LAP. Фермент, подобный E3, обеспечивает перенос фосфатидилэтаноламина (PE) в LC3. Липидизация LC3 включает взаимодействие с комплексом Atg5-12 и Atg16L и белком Beclin1. Комплекс необходим для связывания липидированной формы LC3 с фагосомой, транспортировки НСФ в лизосомальный компартмент для деградации. Значительная часть белков НСФ убиквитинирована и, как следствие, может быть включена в фагосомы, имеющие рецепторы LC3B, меланорегулин или SQSTM1. При этом, только часть POS в фагосоме деградирует под действием LAP. Однако, состав комплекса PI3K, состоящего из субъединиц, участвующих в LAP, отличается от состава комплекса, участвующего в аутофагии. Комплекс LAP содержит белок RUN-домена Rubicon, взаимодействующий с Beclin 1 (Martinez et al., 2015). Клетки РПЭ используют Rubicon, подобно макрофагам, для стимуляции LAP и эффективной деградации фагоцитированного материала клетки. В условиях ОС, в клетках РПЭ снижается LAP фагоцитарная деградация и активируется аутофагия, где ведущую роль принадлежит Atg14 (Muniz-Feliciano et al., 2017).

Аутофагия. В соответствии с современными данными, аутофагия подразделяется на три типа: микроаутофагия, макроаутофагия и шаперон-зависимая аутофагия. У млекопитающих эти три основных пути аутофагии используют механизмы лизосомальной деградации субстратов. Макроаутофагия включает образование аутофагосом – двух мембранных везикул – для транспортировки субстратов в лизосомы для деградации. При шаперон-опосредованной аутофагии деградация субстрата в лизосомах регулируется взаимодействием мембранного рецептора лизосом LAMP2 и шаперона Hsc70 (Morel et al., 1017).

Аутофагия, опосредованная шаперонами (Chaperone-Mediated Autophagy, CMA). CMA активируется при ОС, длительном недостатке питательных веществ или воздействии токсичных веществ, и не требует формирования везикул или серьезной реорганизации лизосомальной мембраны. Эта форма аутофагии обеспечивает направленный транспорт частично денатурировавших белков из цитоплазмы в лизосомы, при участии цитоплазматических белков-шаперонов семейства hsp-70 (heat shock protein 70), вспомогательных белков и LAMP-2 (lysosome-associated membrane protein type 2A). В CMA участвует комплекс белков шаперонов (Hsp70, Hsp40, Hsp90), которые связывают в цитозоле субстратные белки, имеющие специфическую метку KFERQ and транспортируют их через канал, сформированный трансмембранными белками LAMP-2A в полость лизосомы, где они расщепляются ферментами лизосом (Majeski et al., 2004). Существует группа белков-шаперонов, которые взаимодействуют с HSC70 и регулируют его активность, а также могут сами выступать в качестве шаперонов. К ним относятся белок теплового шока 40 (HSP40), стимулирующий АТФазную активность HSC70; белок, взаимодействующий с HSC70 (HIP), стимулирующий сборку комплекса; организующий белок HSC70–HSP90 (HOP), связывающий шапероны HSC70–HSP90. Первая точка регуляции CMA образована целевыми белками, которые становятся более доступными после окисления. Это отчасти связано с тем, что окисленные белки легче разворачиваются, что необходимо для их транспортировки через лизосомальную мембрану. Другой точкой регуляции CMA является LAMP2A. Окисление субстратных белков повышает активность лизосом в CMA за счёт повышения уровня LAMP-2A в лизосомальной мембране и HSC70 в просвете лизосом (Kiffin et al., 2004). Лизосомальная форма Hsp90 (Lys-Hsp90) участвует в поддержании стабильности LAMP2A, в то время как Lys-Hsc70 индуцирует разборку и сборку LAMP2A для нового цикла. CMA при воздействии ОС опосредована генерацией АФК митохондриями и активацией антиоксидантного фактора транскрипции Nrf2. У млекопитающих NRF2 выполняет роль позитивного регулятора CMA, посредством связывания с регуляторными элементами гена LAMP2 и усиления его транскрипции (Pajares et al., 2018). В то же время, передача сигналов, опосредованная RARα (рецепторы ретиноевой кислоты-α), негативно регулирует транскрипцию компонентов CMA, включая LAMP2A (Anguiano et al., 2013). Регуляция активности CMA, динамика сборки и разборки транслокационного комплекса CMA на мембране лизосом осуществляется под контролем сигнальных путей, с участием киназ Akt и TORC2. Выявлена роль лизосома-ассоциированной формы GFAP (глиального фибриллярного кислого белка) в стабилизации данного мультимерного транслокационного комплекса, в ответ на ОС (Arias et al., 2010).

Микроаутофагия — это катаболический процесс, при котором дисфункциональные или избыточно продуцируемые белки и органеллы доставляются непосредственно в эндосомы или лизосомы (Fleming et al., 2022). Все пути микроаутофагии у млекопитающих в конечном итоге направляют субстратные белки в эндосомы/мультивезикулярные тельца (LE/MVB) (Krause, Cuervo, 2021). Этот процесс во многом зависит от комплексов сортировки эндосом, систем транспорта (ESCRT) I и III, и белка-шаперона hsc70. Деградация цитозольных белков в LE/MVB во время эндосомальной микроаутофагии, как и в случае CMA, может потребовать распознавания специфичного мотива, подобного KFERQ белками шаперонами HSC70 (Kirchner et al., 2019). HSC70 связывается с фосфатидилсерином на мембране LE/MVB, запуская интернализацию субстрата в просвет эндосомы, путем инвагинации мембраны, ESCRT-зависимым образом. Деградация белка-субстрата может происходить в полости LE/MVB, хотя деградация основной части белка-субстрата происходит после слияния LE/MVB с лизосомой (Morozova et al., 2016).

Программируемая клеточная гибель и шапероны. Регуляция выживания клеток и их гибели находится под строгим контролем в процессе развития эукариот и гомеостаза тканей. В нормальных физиологических условиях эндогенные защитные системы поддерживают клеточный гомеостаз, а в условиях стресса они могут активировать разные типы запрограммированной клеточной гибели (Рисунок 2; таблица 1). Регулируемая гибель клеток (ПГК) включает множество субпрограмм, выполнение которых приводит к различным морфологическим изменениям. Гибель клеток РПЭ происходит путем апоптоза, некроза, пироптоза и ферроптоза в условиях клеточного стресса, процессе старения и патологии (Newton et al., 2024).

Сокращения: ASC – апоптоз-ассоциированный Speck-подобный белок, содержащий С-концевой домен рекрутирования каспазы, CARD; MLKL – киназный домен смешанной линии, подобный псевдокиназе; NLRP3 – инфламмасома (криопирин); PS – фосфатидилсерин; RIPK – Рецептор-взаимодействующая серин/треонин-протеинкиназа 1