Каждая реакция клетки на изменения в микроокружении, будь то воспалительный ответ или индукция дифференцировки, ассоциирована со сменой профиля экспрессии специализированных белков. Сигнальные каскады, запускаемые рецепторами на мембране, передают сигнал по цепи к транскрипционным факторам, связывающим ДНК, напрямую вовлеченным в инициацию или подавление экспрессии генов-мишеней. Транскрипционные факторы как правило состоят из одного или нескольких ДНК- связывающих и активационных доменов. ДНК-связывающие домены отвечают за специфичность взаимодействия с регуляторными элементами генома, такими как промоторные или энхансерные области. Активационные домены часто имеют неупорядоченную структуру (intrinsically disordered regions, IDR). Неупорядоченные домены присутствуют у значительной части транскрипционных факторов и коактиваторов и способствуют их кооперации посредством формирования водородных связей, электростатических или гидрофобных взаимодействий. Транскрипционные факторы с такими доменами способны формировать особые конденсаты на основе жидко- жидкостного разделения фаз. В настоящее время формирование конденсатов считается важным аспектом инициации транскрипции (рис.1) (Boija et al., 2018; Shukla et al., 2022).

Рис. 1. Предположительные механизмы формирования транскрипционного хаба посредством транскрипционных факторов. Левая верхняя панель: пионерные транскрипционные факторы связывают ДНК на нуклеосомах и стимулируют ремоделинг хроматина, делая его более доступным для других транскрипционных факторов. Кооперативная работа множества транскрипционных факторов приводит к активации энхансера. Верхняя правая панель: связывание транскрипционных факторов с энхансерами может стимулировать к усилению аналогичного связывания с близкими энхансерами. Нижняя левая панель: слабые мультивалентные взаимодействия доменов с неупорядоченной структурой транскрипционных факторов и комплексов, находящихся на энхансерах и промоторах, может приводить к формированию фазовых конденсатов. Нижняя правая панель: Модель градиента активности транскрипционных факторов, предполагающая, что посттрансляционно-модифицированные транскрипционные факторы могут распространяться на соседние промоторы по принципу градиента (Shukla et al., 2022)

Способность формировать конденсаты на основе жидко-жидкостного взаимодействия была выявлена для членов сигнального каскада YAP/TAZ/TEAD. Членов этого каскада часто включают в сигнальный путь Hippo (рис.2), активация которого приводит к фосфорилированию YAP/TAZ и их деградации в цитоплазме. Когда этот каскад инактивирован, YAP1 и TAZ транслоцируются в ядро, где связывают транскрипционные факторы семейства TEAD и запускают транскрипционную программу, контролирующую процессы клеточной дифференцировки, поддержания стволового состояния пролиферацию, миграцию и т. д., в зависимости от клеточного контекста. Помимо каскада Hippo в регуляцию сигнального пути YAP/TAZ/TEAD вовлечены пути NOTCH, WNT и др. Сигнальный каскад YAP/TAZ/TEAD часто оверактивирован при канцерогенезе.

Рис. 2. Сигнальный каскад Hippo. Активация каскада зависит от целого спектра внешних сигналов, в том числе изменений в структуре цитоскелета, различных рецепторов, ассоциированных с G-белками (GPCR), энергетического стресса, формирования межклеточных контактов и клеточной полярности. При активном каскаде Hippo комплекс MST1/2-SAV1 фосфорилирует LATS1/2-MOB1A/B, которые в свою очередь фосфорилируют YAP/TAZ. В случае супрессии каскада Hippo, YAP/TAZ транслоцируются в ядро, связывают транскрипционные факторы TEAD, что стимулирует TEAD-опосредованную транскрипцию генов-мишеней (Shen et al., 2023) .

YAP1 способен к формированию конденсатов только в стрессовых условиях: при гиперосмотическом шоке или при обработке INFγ (Cai et al., 2019; Hao et al., 2022; Yu et al., 2021) . В то же время способность к жидко-жидкостному разделению фаз была показана для TAZ в обычных условиях. Конденсаты этого транскрипционного кофактора содержали TEAD4, а также коактиваторы BRD4 и MED1 (Lu et al., 2020) . В приведенной работе Шао, вышедшей в начале 2024 года, выявили важную роль белка FUS в поддержании транскрипционной активности TAZ при формировании конденсатов (Shao et al., 2024).

В первую очередь авторы работы изучили набор белков, с которым контактирует TAZ при формировании конденсатов. Для этого использовали метод масс-спектрометрии с кросс- линкером, при этом кросс-линкер специально улучшили для этой задачи. Для изучения интерактома конденсаты, состоящие из рекомбинантного белка GFP-TAZ, получали in vitro совместно с экстрактом ядер клеток HeLa (рис.3а). Наблюдали как формирование конденсатных капель из GFP-TAZ, так и их разрушение под воздействием 1,6- гександиола (рис.3b). Протеомный анализ выявил 63 и 21 белок , взаимодействующий с TAZ, в условиях формирования конденсатов и при их разрушении 1,6-гександиолом соответственно, из них 16 белков встречались в обоих состояниях (рис.3с). Анализ показал, что в условиях жидко-жидкостного разделения фаз TAZ контактирует с белками, отвечающими за связывание РНК, сплайсинг, процессинг, иммунный ответ и репарацию (рис. 3d). Также выявили, что в условиях разделения фаз комплексы с TAZ были обогащены FUS и CDK9 (рис.3e). Формирование комплексов с этими белками дополнительно подтвердили вестерн-блотом (рис.3f). В дальнейшей работе авторы сконцентрировались именно на функциях FUS.

Рис. 3. Анализ интерактома TAZ в конденсатах. а. Дизайн эксперимента. Рекомбинантный GFP-TAZ смешали с ядерным экстрактом (NE) для индукции формирования конденсатов, затем сшивали с разработанным кросслинкером (L-NHSF) для стабилизации межмолекулярных взаимодействий внутри конденсатов. Конденсаты далее очищали и анализировали методом жидкостной хроматографии и масс- спектрометрии для определения связанных белков. b. GFP–TAZ и 1,6-гександиол (5%) (1,6 Hex) смешивали с ядерным экстрактом для анализа динамики формирования конденсатов. Масштабный отрезок 50 µm. с. Диаграмма Виенна, демонстрирующая количество белков, ассоциированных с TAZ в условиях фазовой сепарации и ее отсутствии. d. Сеть функциональных взаимодействий белков, ассоциированных с конденсатами TAZ. Взаимодействия рассчитаны на основе базы данных STRING. е. График рассеяния данных на основании выявленных белков. Ось х - log2(fold change) частоты встречаемости TAZ в интерактоме в условиях фазового разделения в сравнении с отсутствием фазового разделения. Значительно представленные белки обозначены красным и синим. f. GFP или GFP–TAZ, смешанные с ядерным экстрактом, были использованы для ко-седиментации в условиях формирования конденсатов и проанализированы методом вестерн-блоттинга.

Оверэкспрессия FUS препятствовала формированию капель из GFP-TAZ (рис.4а), в то время как его нокдаун стимулировал формирование конденсатов (рис.4b). Аналогичный эффект обнаружили при стимуляции формирования конденсатов белка YAP. Исследования влияния белка FUS на формирование конденсатов GFP-TAZ на фоне активации и ингибирования каскада Hippo показало, что взаимодействие между FUS и TAZ не зависит от этого каскада.

Рис. 4. FUS препятствует фазовой сепарации TAZ. a. Изображения (слева) и количественный обсчет (справа) клеток, несущих GFP–TAZ одиночно или совместно с FUS. b. Изображения (слева) или количественный обсчет (справа) влияния нокдауна FUS на формирование конденсатов GFP-TAZ.

Авторы получали различные модифицированные варианты белка FUS, чтобы исследовать механизм его взаимодействия с TAZ. Удаление домена LCD (low complexity sequence domain) блокировало взаимодействие FUS-TAZ. Далее путем мутагенеза этого домена, а также серией дополнительных экспериментов с модуляцией активности фосфатаз и ДНК связанных протеинкиназ, было выявлено, что фосфорилирование LCD препятствует его инкорпорированию в конденсаты TAZ.

Еще при протеомном анализе была предсказана важность домена CC (coiled-coil) белка TAZ для взаимодействия с FUS. Методом конфокальной микроскопии выявили, что GFP- FUS-LCD колокализуется с mCherry-CC, но не с mCherry-WW, другим доменом белка TAZ (рис. 5 a,b). Результаты подтвердили анализом FRET (флуоресцентно-резонансный трансфер энергии), где СFP-TAZ, в качестве донора, передавал энергию YFP-FUS, только при взаимодействии с нативным белком, но не при делеции CC-домена (рис.5c).

Рис. 5. FUS-LCD взаимодействует с СС-доменом TAZ для формирования конденсатов. a,b. U2OS-LacO клетки, трансфецированные GFP–LacI-FUS-LCD совместно с mCherry–CC (а) или mCherry–WW (b) и исследованные методом конфокальной микроскопии. Внизу точечные графики изменений интенсивности свечения GFP и mCherry вдоль пунктирной линии на верхнем изображении. с. FRET-микроскопия клеток, экспрессирующих CFP-TAZ и YFP-FUS. Верхняя линия – изображения CFP и YFP. Нижняя линия – нормализованные изображения FRET. Нижний график демонстрирует нормализованные результаты FRET.

Следующей поставленной целью было определение функций белка FUS, которые он выполняет в конденсатах, образованных TAZ. Авторы обратили внимание, что капли, образованные TAZ, при инкубации с mCherry-FUS-LCD имеют округлую форму, однако в контрольных условиях формируют структуры, напоминающие агрегаты (рис. 6а). Конденсаты, сформированные посредством разделения фаз, могут переходить из жидкого состояния в гелеобразное и даже твердое. Авторы провели анализ восстановления флуоресценции (FRAP), который выявил большую подвижность TAZ в присутствии FUS (рис.6 b,с). Последующие эксперименты показали, что FUS делает конденсаты TAZ более чувствительными к агенту, разрушающему фазовые переходы. Нокдаун FUS приводил к обратным эффектам. Дополнительно авторы исследовали белки, также входящие в конденсаты TAZ: TEAD4, CycT1 и BRD4. Нокдаун FUS также снижал и их подвижность. Таким образом FUS сохранял жидкое состояние конденсатов TAZ, что также способствовало инкорпорированию других белков в эти конденсаты.

Рис. 6. FUS способствует поддержанию жидкостного состояния конденсатов TAZ. а. Изображения конденсатов GFP-TAZ совместно с mCherry (контроль) и mCherry-FUS-LCD, полученные методом конфокальной микроскопии на различных сроках. b. FRAP конденсатов, сформированных GFP-TAZ совместно с mCherry (контроль) и mCherry-FUS-LCD. Изображения на разных сроках восстановления свечения. с. График, описывающий динамику восстановления флуоресценции.

Подобное жидкое состояние конденсатов важно для эффективного взаимодействия между транскрипционными факторами и другими белками в конденсатах, что в свою очередь необходимо для активации транскрипции. Клеточную линию, содержащую YAP- и TAZ-чувствительный репортер, использовали для оценки влияния подавления и оверэкспрессии FUS на экспрессию YAP/TAZ-зависимых мишеней (рис.7a,7b). Оверэкспрессия FUS значительно увеличивает уровень экспрессии мишеней, в то время как его нокаут оказывает эффект, сравнимый с нокаутом TAZ. Далее при работе с линией MCF10 с оверэкспрессией TAZ авторы обнаружили 588 зависимых от TAZ мишеней (рис. 7с), экспрессия которых значительно подавляется нокдауном FUS (рис.7d). FUS оказался вовлеченным в туморогенные свойства TAZ. Изначально нетуморогенная линия MCF10 приобретала такие характеристики при оверэкспрессии TAZ и его нечувствительной к LATS1/2 форме TAZ 4SA. Нокдаун FUS подавлял рост колоний туморогенных клеток (рис.7е,7f) и далее снижал интенсивность опухолевого роста при инъекции клеток в иммунодефицитных мышей (рис.7g).

Рис. 7. FUS обеспечивает транскрипционнуюактивность и онкогенность TAZ. a,b. TAZ-зависимая активация экспрессии системы 8×GTIIC-luciferase, измеренная в клетках, трансфецированных TAZ совместно с mCherry (контроль) или mCherry–FUS (a) или при нокдауне FUS (b). с. График рассеяния данных, демонстрирующий дифференциальную экспрессию генов на основании РНК-секвенирования клеток MCF10A и MCF10A-TAZ. d. Анализ генного обогащения с TAZ-опосредованным повышением экспрессии при нокдауне FUS. e,f. Формирование колоний MCF10A и MCF10A-TAZ (MCF10A-TAZ-4SA) с нокдауном FUS в мягком агаре. g. Опухоли, образованные MII-TAZ-4SA клетками на фоне нокдауна FUS.

Кратко свои выводы авторы сформулировали на следующем рисунке (рис.8). FUS необходим для функционирования конденсатов белка TAZ и инициации транскрипции генов-мишеней. LCD-домен FUS взаимодействует с CC-доменом TAZ, сохраняя жидкое состояние конденсатов.

Рис. 8. Предполагаемая модель регуляции фазовой сепарации посредством FUS.

Сигнальному каскаду YAP/TAZ/TEAD отведено значительное место в современной биологии развития, клеточной биологии и регенеративной медицине. Его изучают в контексте раннего эмбрионального развития, тканевых морфогенезов, функционирования стволовых клеток и опухолевой прогрессии при канцерогенезе. Исследование функционирования комплекса YAP/TAZ/TEAD в ядре позволит лучше понять механизмы опосредованной регуляции экспрессии мишеней и взаимной компенсации белков- паралогов при работе этого сигнального каскада. В частности, авторы этого исследования выявили, что при нарушении формирования конденсатов при нокдауне FUS транскрипционный кофактор TAZ не функционирует. Применение вертепорфина оказывало схожее влияние с нокдауном FUS на транскрипцию TAZ-зависимых мишеней. Вертепорфин – ингибитор сигнального пути YAP/TAZ, блокирующий его связывание с транскрипционными факторами TEAD. Такой механизм его действия предполагает, что он может разрушать фазовые конденсаты, сформированные YAP/TAZ/TEAD. Негативное влияние вертепорфина и его аналогов на фазовые переходы было показано в другой работе при исследовании формирования конденсатов из YAP1 (Hao et al., 2022) . Таким образом, поиск агентов, блокирующих конденсацию YAP/TAZ/TEAD может стать новым направлением при разработке средств терапии раковых опухолей. Фазовые переходы при функционировании белков YAP/TAZ/TEAD – дополнительный уровень регуляции, который необходимо учитывать при работе с этим сигнальным каскадом.

Список литературы:

1. Boija, A., Klein, I.A., Sabari, B.R., Dall’Agnese, A., Coffey, E.L., Zamudio, A.V., Li, C.H., Shrinivas, K., Manteiga, J.C., Hannett, N.M., Abraham, B.J., Afeyan, L.K., Guo, Y.E., Rimel, J.K., Fant, C.B., Schuijers, J., Lee, T.I., Taatjes, D.J., Young, R.A., 2018. Transcription Factors Activate Genes through the Phase-Separation Capacity of Their Activation Domains. Cell 175, 1842-1855.e16. DOI: 10.1016/j.cell.2018.10.042
2. Cai, D., Feliciano, D., Dong, P., Flores, E., Gruebele, M., Porat-Shliom, N., Sukenik, S., Liu, Z., Lippincott-Schwartz, J., 2019. Phase separation of YAP reorganizes genome topology for long-term YAP target gene expression. Nat. Cell Biol. 21, 1578–1589. DOI: 10.1038/s41556-019-0433-z
3. Hao, S., Fuehrer, H., Flores, E., Demmerle, J., Lippincott-Schwartz, J., Liu, Z., Sukenik, S., Cai, D., 2022. YAP condensates are highly organized hubs for YAP/TEAD transcription. DOI: 10.1101/2022.10.24.513621
4. Lu, Y., Wu, T., Gutman, O., Lu, H., Zhou, Q., Henis, Y.I., Luo, K., 2020. Phase separation of TAZ compartmentalizes the transcription machinery to promote gene expression. Nat. Cell Biol. 22, 453–464. DOI: 10.1038/s41556-020-0485-0
5. Shao, Y., Shu, X., Lu, Y., Zhu, W., Li, R., Fu, H., Li, C., Sun, W., Li, Z., Zhang, Y., Cao, X., Ye, X., Ajiboye, E., Zhao, B., Zhang, L., Wu, H., Feng, X.-H., Yang, B., Lu, H., 2024. A chaperone-like function of FUS ensures TAZ condensate dynamics and transcriptional activation. Nat. Cell Biol. 26, 86–99. DOI: 10.1038/s41556-023-01309-3
6. Shen, X., Li, Q., Sun, Y., Chen, L., Xue, F., Tian, W., Wang, Y., 2023. The Hippo pathway in endometrial cancer: a potential therapeutic target? Front. Oncol. 13, 1273345. DOI: 10.3389/fonc.2023.1273345
7. Shukla, V., Cetnarowska, A., Hyldahl, M., Mandrup, S., 2022. Interplay between regulatory elements and chromatin topology in cellular lineage determination. Trends Genet. TIG 38, 1048–1061. DOI: 10.1016/j.tig.2022.05.011
8. Yu, M., Peng, Z., Qin, M., Liu, Y., Wang, J., Zhang, C., Lin, J., Dong, T., Wang, L., Li, S., Yang, Y., Xu, S., Guo, W., Zhang, X., Shi, M., Peng, H., Luo, X., Zhang, H., Zhang, L., Li, Y., Yang, X.-P., Sun, S., 2021. Interferon-γ induces tumor resistance to anti-PD-1 immunotherapy by promoting YAP phase separation. Mol. Cell 81, 1216-1230.e9. DOI: 10.1016/j.molcel.2021.01.010

Новость подготовили
© Е.П. Калабушева
© С.В. Ульянов
09.02.2024