Гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) - мультипотентные клетки, способные к самовоспроизведению и дифференцировке во все ростки кроветворения. Эти характеристики ГСК лежат в основе использования трансплантации ГСК для лечения многих гематологических, онкологических и генетических заболеваний. До настоящего времени для получения ГСК используют, в основном, различные режимы их мобилизации, задача экспансии (наращивания) необходимых количеств ГСК ex vivo не решена. Большинство предложенных протоколов наращивания ГСК ex vivo основаны на использовании различных комбинаций ростовых факторов и цитокинов, таких как SCF, Flt3, TPO, IL-3, IL-6. При этом, однако, в большинстве случаев отмечается дифференцировка ГСК c образованием прогениторных клеток; поддержания длительно репопулирующих ГСК (long-term HSC, LT-HSC) добиться не удается.

Работа Wilkinson и соавторов посвящена отработке протокола наращивания функционально-активных ГСК ex vivo в модельной системе (ГСК мыши). Авторы провели подбор оптимальных концентраций ростовых факторов, используемых для наращивания ГСК (thrombopoietin (TPO) и stem-cell factor (SCF)), подобрали оптимальный протокол смены среды при культивировании клеток, предложили подложку и заменитель сывороточного альбумина человека, что в совокупности обеспечило экспансию ГСК в культуре и получение функционально-активных клеток, способных при трансплантации давать длительное восстановление кроветворения.

Принцип использованного подхода основан на выделении ГСК из костного мозга (КМ) мышей (клетки CD34-c-KIT+Sca+ Lin- (KSL) или CD150+CD34-c-KIT+Sca+ Lin-), их культивировании в различных условиях и определении эффективности генерации ГСК в конкурентном трансплантационном тесте. Последний основан на совместном переносе клеток, полученных в культурах, и несортированных клеток КМ (1х106 клеток) летально облученным реципиентам с последующим определением процента реципиентов с химеризмом клеток крови.

На первом этапе в краткосрочных семидневных культурах было проведено кросс-титрование факторов TPO и SCF и определены дозы, оптимальные для генерации ГСК (ими оказались 100 нг/мл TPO и 10 нг/мл SCF, т.е. высокая доза TPO и низкая доза SCF). Далее авторы оценили реконституционную способность клеток, полученных в долгосрочных (1 месяц) культурах. Оказалось, что результаты зависели от условий смены среды в процессе культивирования: при замене половины объема среды, полученные клетки обладали только краткосрочной реконституционной способностью, при полной смене среды – длительной реконституционной способностью.

В связи с необходимостью полной смены среды в процессе культивирования ГСК, встал вопрос об обеспечении сохранности клеток в процессе смены среды. Было проведено сравнение пяти способов покрытия лунок (пластик без покрытия, покрытие коллагеном 1, коллагеном 4, фибронектином, желатином, ламинином 511) и найдено, что наиболее высокий процент химеризма в конкурентном трансплантационном тесте давали клетки, полученные на фибронектине (100% химеризм через 16 недель после трансплантации), что хорошо согласуется с литературными данными о роли фибронектина в поддержании ГСК в кроветворных нишах КМ.

Исследование состава культуральной среды выявило увеличение содержания в ней ряда провоспалительных цитокинов и хемокинов в процессе культивирования клеток (IL-6, CCL2, CCL3, CCL4). Было предположено, что причиной развития воспалительного ответа является присутствие в среде рекомбинантного альбумина человека (HSA), способного стимулировать воспалительный ответ в связи с примесью ЛПС. В связи с этим был проведен поиск возможных заменителей HSA, показана возможность замены HSA на поливиниловый спирт (PVA). При использовании PVA вместо HSA «ГСК-активность» полученных клеток повышалась, воспалительный ответ и экспрессия генов, ассоциированных с клеточным старением (Trp53, изоформы Cdkn2a p16Ink4a и p19Arf ) снижались. Возможность замены HSA на PVA была также продемонстрирована при культивировании клеток человека - CD34+ клеток пуповинной крови и прогениторных клеток.

Подобранные авторами условия наращивания ГСК (100 нг/мл TPO, 10 нг/мл SCF, 87% PVA на фибронектине) обеспечивали 8000-кратное увеличение клеток CD150+CD34-KSL за 28 дней культивирования. С использованием метода лимитирующих разведений и конкурентной трансплантации была определена частота ГСК, которая составила 1:3.8 функциональных ГСК в свежеизолированных клетках CD150+CD34-KSL и 1:34.4 клеток на 28 день культивирования (суммарно 1.2х104 ГСК на 28 день, экспансия ГСК в 236-899 раз).

Был также проведен перенос клеток КМ, полученных от первичных реципиентов, вторичным реципиентам (1х106 клеток КМ реципиентов, получивших при первичной трансплантации 100 или 50 клеток из культур ГСК), и показано, что у всех вторичных реципиентов отмечался химерзим клеток крови, что подтвердило длительную «ГСК-активность» клеток, полученных в подобранных авторами условиях. Показано, что 28-дневные ГСК не экспрессируют маркеры старения, кариотипически нормальны и, в основном, сохраняют стабильный фенотип KSL (в некоторых количествах в культурах появлялись клетки Lin+ (Ly6G/Ly-6C+) и клетки, экспрессирующие FCER1). Показана возможность поддержания культур более длительное время (57 дней).

Несмотря на использование в исходных культурах фенотипически однородной популяции клеток (CD150+CD34- KSL) авторы отметили гетерогенность ГСК, которая проявлялась в различной способности клеток к экспансии и в фенотипическом разнообразии потомков: при культивировании клеток CD150+CD34- KSL одни клетки давали 100 потомков, другие – 5х105; одни клетки сохраняли свой фенотип, другие давали начало клеткам c-KIT+SCA1-Lin-. Важно, однако, что все фенотипические варианты ГСК обладали высокой способностью к репопуляции.

Обычно для приживления трансплантированных ГСК в эксперименте требуется летальное облучение реципиентов, что связано с необходимостью наличия достаточного количества ниш для трансплантируемых ГСК; для достижения приживления ГСК у необлученных реципиентов необходим перенос больших количеств клеток. Культивирование 50 ГСК в течение 28 дней в условиях, подобранных в настоящей работе, позволяло получать клетки в количествах, достаточных для создания мультилинейного химеризма (включая химеризм Т- и В-лимфоцитов) у необлученных иммунокомпетентных реципиентов.

В целом, в работе разработаны условия культивирования клеток в безальбуминовой среде обеспечивающие поддержание функционально активных ГСК мыши. Авторы полагают, что трудности наращивания функционально активных ГСК ex vivo, существовавшие ранее, связаны с недостаточной оптимизацией условий культивирования и использованием «нечистых» добавок к средам.

Новость подготовила © 2019 Лядова И.В.
08.07.2019