21 октября 2019 в журнале Nature была опубликована научная статья «Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donorDNA» под авторством коллектива исследователей из университетов Кембриджа и Гарварда.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/31634902

Данная статья посвящена новому методу редактирования генома эукариот, основанному на улучшении хорошо всем знакомой и широко используемой системы CRISPR/Cas9. Осмелюсь напомнить аудитории, что в классическом варианте это двухкомпонентная система, состоящая из белка-нуклеазы Cas9, которая создает разрыв в обоих цепях ДНК и короткой последовательности РНК (порядка 100п.н.), называемой гидовой РНК (или направляющей РНК), которая определяет место разрыва по принципу комплементарности (Рис.1).

Данная система отлично себя зарекомендовала в клетках млекопитающих (в т.ч. человека) для создания нокаутирующих мутаций, поскольку после создания разрыва в необходимом месте геномной ДНК, клеточный комплекс репарации по типу негомологичного соединения концов (non-homologous end joining, NHEJ) может вносить ошибки в репарируемую ДНК (чаще всего короткие делеции 1-10п.н.) в зоне разрыва. Которые, уже могут привести к нокауту гена, если место разрыва было запланировано внутри белок-кодирующей последовательности гена. В этом качестве, система CRISPR/Cas9 работает эффективно, воспроизводимо и достаточно «легко» в том смысле, что такие эксперименты не требуют огромных усилий и ресурсов.

Однако, что касается целенаправленного редактирования генома, а именно целенаправленного изменения редактируемой последовательности ДНК, его буквальной записи в том самом виде, в котором мы хотим и никак иначе - здесь классический CRISPR/Cas9 показал себя не с самой лучшей стороны. Предполагается, что в этом случае для целенаправленной записи в геном необходимой последовательности, мы должны воспользоваться системой гомологичной репарации (Homology directed repair, HDR), которая используя т.н. ДНК-донор в качестве образца, запишет нужную последовательность. Для этого нужен ДНК-донор (используют как двухцепочечную ДНК в виде плазмид, так и одноцепочечную ДНК) содержащий плечи гомологии, которые должны фланкировать редактируемый участок слева и справа. Размеры таких гомологичных участков, варьируют в разных исследованиях, но в целом исследователи сходятся во мнении, что даже короткие плечи длиной 50-100п.н.вполне работают. Проблема данной стратегии заключается в том, что очень сложно совместить в одной точке пространства-времени несколько событий и факторов - разрыв ДНК, комплекс HDR и ДНК-Донор. А учитывая, что комплекс NHEJ конкурирует с HDR, и благодаря тому, что ему ДНК-донор как раз не требуется, то NHEJ обычно побеждает. Вследствие этого, обычно эффективность такого целенаправленного редактирования генома крайне низкая – порядка 1-5% в лучшем случае, при условии соблюдения практически идеальных условий эксперимента.

И вот, решив, что дальше так продолжаться не может, коллектив авторов рассматриваемой статьи задался решить эту проблему. Для этого они решили сконструировать химерный белок nCas9 (никаза, мутантный Cas9, у которого отключен один из двух активных центров, и который получил способность резать только одну цепь ДНК) с присоединенным ферментом ревертазой (т.е. РНК-зависимой ДНК полимеразой) от вируса MMLV. Также исследователи сконструировали химерную гидовую РНК (названную ими prime editing gRNA = pegRNA), состояющую из стандартной базовой гидовой РНК с присоединенной к 3’ концу матрицей для ревертазы. При этом на самом конце химерной гидовой РНК находится сайт, комплементарный (порядка 8-15 букв) участку разрезаемой цепи и который служит праймером для посадки ревертазы и начала синтеза цепи ДНК. Общая схема комплекса представлена на Рис.2.

Общая предполагаемая цепь событий при использовании этого хитрого комплекса такова:

1. Весь комплекс связывается с необходимым участком геномной ДНК, после чего двойная цепь расплетается и никаза совершает разрыв цепи на которой находится PAM мотив. Нужно учесть, что редактируемый участок должен находится внутри узнающий последовательности pegRNA – это важно, об этом в конце.
2. Свободный 3’ конец pegRNA с праймером на конце отжигается на порезанную цепь.
3. Ревертаза достраивает цепь ДНК по предложенной матрице, в которой, как предполагается, находится нужная нам замена нуклеотидов. Достраивает, видимо, до некого «тупика», дальше которого ревертаза продвинуться не может из-за пространственно-структурных ограничений комплекса. Важно, чтобы на конце редактируемого и синтезируемого учатска также находились некие буквы гомологии со второй (целой) цепью.
4. После этого комплекс сваливается с ДНК и система застывает в неустойчивом равновесии, когда возле одноцепочечного разрыва находятся два свободно-«болтающихся» конца ДНК, один из которых (новый) заканчивается на 3’ и содержит отредактированные буквы, а второй (старый) начинается с 5’ и НЕсодержит отредактированные буквы.
5. Оба свободных конца конкурируют за вторую целую цепь, и конечно хотя «старый» конец более комплементарен ей чем «новый», и таким образом вроде бы должен побеждать, но из-за того, что 5’ конец ДНК более предпочитаемый субстрат для структурно-специфических эндонуклеаз типа FEN1 (которые таким образом удаляют фрагменты Оказаки в процессе репликаици ДНК), в конце-концов новой отредактированной цепи удается занять место старой цепи с образованием гетеродуплекса.
6. Затем происходит лигирование разорванной цепи и репарация старой по принципу комплементарности, а редактированные буквы занимают свое «законное» место. Возникает вопрос, а почему система должна репарировать старую цепь по примеру новой, а не наоборот? Ответ заключается в том, что если это произойдет, вся история начнется заново с пункта №1 и так раз за разом, пока не произойдет обратное. Надо учесть, что после успешно проведенной репарации, комплекс перестает узнавать данное место, что обеспечивает выход из цикла.

Идея в целом проста до изящества, но конечно сделать в реальной жизни всю систему рабочей было гораздо сложнее, чем представить и произнести на словах. Этому в целом и посвящена статья.

Были опробованы разные способы присоединения праймера – 5’ и 3’ концу гидовой РНК, были опробованы разные линкеры между этими частями, работа комплекса была провалидирована in vitro на молекулах ДНК и на плазмидных конструкциях в клетках, причем сначала это была просто смесь всех компонент, а потом уже все в химерных «фьюз»-вариантах. Была изучена эффективность работы комплекса в зависимости от длины праймера и длины матрицы. Полученный таким образом PE (prime editing) комплекс получил название PE1, т.е. первого поколения, и был признан рабочим вариантом с удовлетворяющей эффективностью (4-17% на локусе HEK3 в клетках HEK293T) работы. Также авторы тут же, как говорится «не отходя от кассы», создали PE комплекс второго поколения (PE2), в котором применили новый, улучшенный вариант ревертазы MMLV, в который были внесены мутации для улучшения термостабильности, процессинга, ДНК-РНК связывания и уменьшения RNAaseH–активности (та которая режет РНК в дуплексах РНК-ДНК). Всего было протестировано 19 (!) различных вариантов новой ревертазы, после чего лучшим был признан вариант с пятью мутациями (увеличение эффективности по сравнению с PE1 в 1,3-3 раза) и система получила название PE2. Для увеличения эффективности работы системы был проведен следующий апгрейд системы до третьего поколения (PE3 и PE3b), в состав которой была введена обычная гидовая РНК для формирования ник-разреза на НЕредактированной цепи (Рис.3) в отдалении от редактируемого участка. Данный ник-разрез ПОСЛЕ события образования гетеродуплекса X’Y, обеспечивает то, что репарироваться будет именно НЕредактированая цепь, что должно значительно увеличить эффективность работы всей системы.

Системы PE3 и PE3b отличаются друг от друга тем, что в случае PE3b гидовая РНК пишется прямо на место редактирования по уже отредактированной последовательности, для того, чтобы обеспечить возникновение ник-разрыва строго ПОСЛЕ события редактирования. После проведения всех тестов было показано, что общая эффективность работы PE3 и PE3b оказалась максимальной из всех наблюдаемых ранее, и составила порядка 30-40% для 1-3 нуклеотидных замен и инсерций, между собой же PE3 и PE3b не отличались по эффективности достоверно, но при этом система PE3b достоверно снижала количество возникающих нежелательных indel-мутаций.

В конце система была проверена на создании/исправлении известных человеческих мутаций, таких как HBB-E6V (в гене бета-глобина, серповидно-клеточная анемия) и HEXA 1278+TATC (в гене HEXA, болезнь Тея-Сакса), а также на трех дополнительных линиях клеток, кроме уже упомянутой HEK293T – на K562, U2OS, HeLa и на культуре кортикальных нейронов мыши. Везде система PE3 показала себя с лучшей стороны, с эффективностью редактирования от порядка 5% до 70% на разных мишенях и локусах.

Итак, чем же все это грозит нам, обычным рядовым труженикам дозаторов и пипеток? По всей видимости тем, что теперь уровень экспериментальных работ по редактированию генома с культурами клеток и другими биологическими объектами вырастет еще на одну ступень (если не на порядок), и конечно же нам необходимо будет освоить этот новый инструмент, чтобы по крайне мере попытаться соответствовать этому уровню. Современные проблемы требуют современных решений.

Многие из указанных в статье конструкций доступны на депозитории Addgene, любой желающий может купить их и попробовать сделать все самому:
http://www.addgene.org/browse/article/28206799/

Новость подготовил © Дашинимаев Э.Б.

31.10.2019