Плюрипотентность как явление является ящиком Пандоры для современной науки, тем не менее ученые разных стран сосредоточены на получении клеток с еще большим потенциалом к дифференцировке. В работе ученые из Вашингтона смогли преодолеть дифференцировочный барьер плюрипотентных стволовых клеток и получить клетки внезародышевой оболочки – трофобласта. Для этого им пришлось прибегнуть к использованию одной из самых актуальных технологий – получению наивных плюрипотентных стволовых клеток. По своим характеристикам наивные плюрипотентные стволовые клетки наиболее близки к бластомерам морулы до разделения на внутреннюю клеточную массу бластоцисты и трофобласт. Классическим протоколом дифференцировки обычных плюрипотентных стволовых клеток в трофобласт-подобные является использование BMP4. В этом случае получаются сходные с трофобластом по своим характеристикам клетки. При коммитировании наивных плюрипотентных стволовых клеток с последующей дифференцировкой авторы получили стволовые клетки трофобласта, а затем закрепили свой успех адаптировав протокол и добавив целую панель факторов роста и малых молекул.

Отдельного внимания заслуживает подход ученых к верификации полученных линий. Клетки верифицировали не только на основании полного транскриптомного анализа, но и акцентировали внимание на профиле доступности хроматина. Благодаря этому, исследователи доказали, что наивные плюрипотентные стволовые клетки дифференцируются не просто в стволовые клетки трофобласта, а определили конкретную стадию развития – 12 сутки после оплодотворения.

Значительный объем полученных данных позволил привлечь для анализа мощную статистическую базу. Методом главных компонент исследователи построили график потенций к дифференцировке наивных стволовых клеток на основании РНК секвенирования. Выяснилось, что наивные клетки могут быть коммитированы либо в направлении классических плюрипотентных клеток, либо в сторону трофобласта. При этом, трофобласт-подобные клетки, полученные из наивных и классических плюрипотентных стволовых клеток, различались радикально - последние оказались скорее нейроэктодермой на основании РНК-профилирования. Далее исследование сосредоточилось на описании молекулярных процессов, протекающих при дифференцировке эктраэмбриональных оболочек. Стволовые клетки трофобласта успешно дифференцировали по 2-м направлениям – в экстраворсинчатый и синцитио- трофобласт. Таким образом, авторы получили полный набор стадий дифференцировки, и использовали его для РНК-секвенирования и кластерного анализа. Дифференциально экспрессирующие гены разбили на 6 основных кластеров: Первый кластер преобладал у плюрипотентных стволовых клеток, в нем располагались гены, ассоциированные с регуляцией транскрипции и эмбриональным развитием. Второй кластер объединял плюрипотентные клетки и стволовые клетки трофобласта, в нем впервые возникали типичные маркеры дифференцировки – LRP5 и важнейший транскрипционный фактор TEAD4. Третий кластер доминировал в стволовых клетках трофобласта, он включал в себя гены, отвечающие за ремоделирование актинового цитоскелета. Кластер 4 объединял стволовые клетки трофобласта и дифференцированную линию экстраворсинчатого трофобласта, в то время как последние 2 кластера являлись общими для двух дифференцированных клеточных линий. Кластеры 4, 5 и 6 включали в себя гены терминальной дифференцировки – для экстраворсинчатого трофобласта были характерны гены, стимулирующие миграцию и инвазию, для синцитиотрофобласта – отвечающие за слияние мембраны и сигналлинг интерферонов.

Исследования профиля доступности хроматина методом ATAC-секвенирования выявило близость стволовых клеток трофобласта к наивным плюрипотентным: Исследователи отметили возрастание количества открытых для связывания участках в интронных и межгенных регионах в стволовых клетках трофобласта.

Авторы объединили результаты РНК и ATAC секвенирования для поиска «мастер-генов» - транскрипционных факторов, сайты связывания которых располагаются в промоторных областях генов, экспрессия которых меняется при дифференцировке. Такие факторы управляют ключевыми событиями при дифференцировке. Таким образом, авторы выявили следующие гены-кандидаты: TEAD4, CEBP, GATA, TFAP2C и др. Литературные данные позволили определить функции и исключить из анализа большую их часть, что позволило исследователям сосредоточиться на TEAD4. TEAD4 является одним из эффекторов каскада Hyppo/YAP, который вовлечен в механосенсорику клеток. Ингибирование этого каскада приводило к гибели дифференцирующихся в направлении трофобласта клеток, что подтвердило ключевую роль этого транскрипционного фактора в судьбе формирующихся экстраэмбриональных оболочек.

Данная статья интересна не только своей новизной – получением клеток трофобласта в культуре, что ранее считалось невозможным, но и детальным подходом к анализу и верификации полученных данных. Тщательное отношение авторов к подтверждению своих результатов за счет РНК и АТАС секвенирования позволило им также определить ключевые гены, вовлеченные в регуляцию дифференцировки трофобласта. Думаю, нам, как исследователям, есть чему у них поучиться.

Новость подготовили © 2020 Калабушева Е.П., Абдыев В.К.
05.03.2020