Технология CRISPR постепенно внедряется в клиническую практику, открывая принципиально новые возможности для лечения наследственных и приобретённых генетических заболеваний, для которых традиционные методы лечения оказываются малоэффективными или вовсе отсутствуют.

На сегодняшний день FDA (Food and Drug Administration) уже одобрило 14 лекарственных препаратов, созданных с применением генной терапии на основе векторов ex vivo, и 21 препарат на основе векторов in vivo. При этом последние два года стали переломными для генной терапии на основе системы CRISPR. В 2023 году был одобрен препарат «CASGEVY», который стал первым в мире препаратом для лечения серповидноклеточной анемии и бета-талассемии.

Однако внедрение данной технологии в клиническую практику сопряжено с рядом трудностей. Уже зафиксированы случаи тяжелых нежелательных явлений, включая летальные исходы. Редактирование генома связано с риском активации онкогенов, хромосомных перестроек и мегабазовых делеций, приводящих к укорочению хромосом. Кроме того, даже при успешном редактировании клеток возможно нарушение процесса репарации ДНК, например, при мутациях TP53, что создает условия для выживания анеуплоидных клонов. Хотя эти геномные изменения наиболее подробно изучены в контексте системы CRISPR, аналогичные эффекты наблюдались и при использовании других платформ, индуцирующих двухцепочечные разрывы, таких как ZFN и TALEN.

В связи с этим возрастает необходимость проведения детального анализа эффективности редактирования генома, биораспределения, рисков нецелевых изменений и потенциальной генотоксичности. Вследствие этого возникает потребность в разработке новых методов прогнозирования и мониторинга, направленных на минимизацию рисков возникновения побочных эффектов генной терапии.

В статье «Monitoring biological effects of somatic cell genome editing» авторы представляют ключевые технологические методы для оценки безопасности, точности и биологической эффективности редактирования генома на различных уровнях (см. рис. 1):

1. На молекулярном уровне – для подтверждения целевых и нецелевых генетических изменений;

2. На тканевом уровне – для оценки фенотипических изменений;

3. На уровне целого организма – для анализа биораспределения, приживаемости и длительности эффекта.

Как измерить редактирование ДНК?

В первой части статьи перечислены основные аналитические методы обнаружения и количественной оценки эффективности редактирования генома (см. таблицу 1). Авторы отмечают, что все события редактирования делятся на on-target (целевые) и off-target (нецелевые).

К быстрым и сравнительно недорогим, но менее точным методам относятся Surveyor, T7E1, капиллярный электрофорез (IDAA) и флуоресцентные репортерные системы. Такие методы хорошо выявляют небольшие вставки или делеции, однако малоэффективны для обнаружения и количественной оценки крупных перестроек (>500 bp), инверсий, транслокаций и интеграции AAV в геном. Поэтому данные методы полезны на ранних этапах скрининга генетической последовательности, но не могут заменить более глубокую валидацию.

Эти ограничения преодолеваются с помощью секвенирования по Сэнгеру, цифровой капельной ПЦР (ddPCR) и NGS (Next Generation Sequencing). Благодаря своей низкой стоимости, простоте и очень высокой точности секвенирование по Сэнгеру остается основным методом для выявления мутаций в небольших участках ДНК. Его часто используют для подтверждения базового редактирования и выявления гомо- и гетерозиготных вариантов. Программы EditR и BEAT (Base Editing Analysis Tool) позволяют количественно оценить эффективность редактирования генома на основе хроматограмм. Недостаток этого метода заключаются в низкой чувствительности к редким мутациям и сложности интерпретации смешанных популяций. ddPCR, напротив, обладает высокой чувствительностью и позволяет количественно оценивать широкий спектр событий редактирования, включая однонуклеотидные замены и крупные делеции (от 1 bp до 1 Mb). Однако ddPCR требует заранее спроектированных праймеров и поэтому не распознает неожиданные перестройки. Метод не позволяет выявлять делеции, превышающие ожидаемый размер, или сложные перестройки, нарушающие связывание праймеров или зондов. NGS произвел революцию в детекции точечных мутаций, поскольку обладает более высокой чувствительностью и точностью по сравнению с другими методами. Он позволяет выявлять и количественно оценивать редкие генетические варианты, в том числе низкочастотные события редактирования, а также оценивать эффективность, специфичность и распространенность различных типов генетических изменений. Однако метод также зависит от подбора праймеров, что снижает эффективность для обнаружения крупных перестроек (>100 bp). Для преодаления этих ограничений авторы отдельно выделяет методы UDiTaS (Uni-Directional Targeted Sequencing methodology), PacBio и Oxford Nanopore, которые лучше подходят для выявления сложных off-target событий.

Важный вывод здесь состоит в том, что универсального метода мониторинга целевых изменений генома после редактирования не существует. Выбор подходящего подхода должен определяться используемой технологией редактирования, характером мишени и предполагаемыми рисками.

Далее значительная часть статьи посвящена нецелевым событиям редактирования. Именно они могут приводить к серьезным и долгосрочным последствиям. Таким образом, клиническая безопасность определяется не только непосредственной эффективностью терапии, но и потенциально отсроченными рисками, которые могут проявиться спустя длительное время.

Для выявления участков с высоким риском нецелевой активности предлагается трехступенчатый подход. На первом этапе используют вычислительное прогнозирование с применением инструментов анализа нуклеотидных последовательностей (COSMID, CCTop и Cas-OFFinder) и алгоритмов машинного обучения (Elevation, DeepCRISPR и CRISPR-Ne). Эти методы позволяют быстро и с минимальными затратами оценить риск для конкретной направляющей РНК (гРНК) и исключить потенциально опасные варианты, связывающиеся с нецелевыми участками генома. Однако одних вычислительных методов недостаточно для получения разрешения регулирующих органов. На втором этапе проводят биохимические анализы in vitro (Digenome-seq и SITE-seq, CIRCLE-seq и CHANGE-seq, ONE-seq и их аналоги), позволяющие детектировать участки, расщепляемые нуклеазой Cas9. При этом такие методы не в полной мере воспроизводят условия клеточной среды, поэтому их рассматривают как промежуточный этап, но не как окончательное подтверждение безопасности генной терапии. На заключительном этапе авторы анализируют методы выявления нецелевых событий редактирования на более физиологическом уровне. К ним относятся BLISS, GUIDE-seq и DISCOVER-seq, преимущество которых состоит в том, что они способны детектировать двуцепочечные разрывы ДНК и следы активной репарации непосредственно в специализированных клетках, а не только в искусственных тестовых системах.

Важно отметить, что перед клиническим внедрением технологий редактирования необходимо комбинировать вычислительные и эмпирические методы для выявления нецелевых эффектов, поскольку результаты, полученные на разных платформ, могут различаться.

Профиль нецелевых off-target изменений не является универсальным, он может варьироваться между клеточными линиями и донорами. Поэтому авторы рекомендуют учитывать не один эталонный геном человека, а более широкий набор генетических вариаций, чтобы не пропустить уникальные локусы в популяции. В качестве инструмента, учитывающего разнообразные SNP и инделы, приводится CRISPRme. В практическом смысле это означает, что доклиническая оценка должна быть не абстрактной, а максимально приближенной к реальному пациенту, к его клеточному типу и генетическому фонду.

Микрофизиологические системы: органоиды и микрофлюидные чипы

Следующий уровень мониторинга направлен на оценку фенотипических последствий редактирования в клетках и тканях. С помощью микрофизиологических систем становится возможным воссоздание моделей человеческих органов с характерными генетическими и фенотипическими особенностями конкретного пациента. Такие системы дают возможность оценить влияние генетических изменений на функционирование органов, включая печень, почки, сердце, мозг и тд. Авторы обзора акцентируют внимание на том, что органоиды и микрофлюидные чипы способны моделировать сложные межклеточные взаимодействия и механизмы развития заболеваний более эффективно, чем простые клеточные культуры.

Поскольку микрофизиологические системы появились сравнительно недавно, они имеют ряд существенных ограничений. Большинство из них все еще создаются из диссоциированных клеток или клеток-предшественников, а не из полностью сформированных тканей. Вследствие этого у них отсутствуют естественные проводящие пути, а также они не способны в полной мере воспроизводить все межклеточные взаимодействия. Кроме того, проблемы масштабирования пока не позволяют использовать их как полноценную замену другим системам мониторинга. Однако авторы приводят убедительные примеры успешного редактирования разных генов в микрофизиологических системах (см. таблицу 2).

Визуализация in vivo организма

Также микрофизиологические системы обладают ограниченными возможностями для изучения динамических процессов, происходящих в организме, включая локальное распределение, воспаление и физиологические функции. В третьем разделе статьи авторы обсуждают метод неинвазивной визуализации in vivo, который обеспечивает «макроуровневый» мониторинг биораспределения, приживаемости и длительности действия системы редактирования генома непосредственно в организмах. Это особенно важно при доставке in vivo, поскольку терапевтический эффект зависит от селективного накопления препарата в целевом органе. В идеале такие технологии должны обеспечивать получение биомаркеров в режиме реального времени для отслеживания как целевых, так и нецелевых событий редактирования генома.

В этом разделе статьи объясняется различие между прямым и непрямым мечением терапевтических клеток. Прямое мечение (с использованием радиоизотопов или магнитных наночастиц) обеспечивает количественную оценку и высокую чувствительность, однако сигнал быстро ослабевает по мере пролиферации клеток. Непрямое мечение, основанное на использовании репортерных генов, сохраняется дольше, но требует более сложной разработки и дополнительного регуляторного контроля.

Существует несколько платформ для визуализации распределения терапевтических препаратов в организме. Для этого используют набор доклинических и клинических методов визуализации, каждый из которых имеет свои особенности и решает конкретные задачи (см. таблицу 3).

Авторы подчеркивают, что, несмотря на высокий потенциал технологий редактирования генома, терапевтический успех по-прежнему упирается в три базовые проблемы: доставку, безопасность и воспроизводимость результатов. Глубокий анализ ДНК, клеточные модели человека и методы визуализации дополняют друг друга, выявляя слабые места генной терапии. Эффекты, выявленные на уровне ДНК как нецелевые, могут не проявляться на тканевом уровне и не вызывать побочных реакций. В то же время корректное редактирование целевого гена способно приводить к цитотоксичности из-за индивидуальных особенностей пациента. В связи с этим авторы предлагают не универсальное решение, а многоуровневый подход к мониторингу событий редактирования, при котором различные платформы используются совместно для минимизации побочных эффектов генной терапии.

Новость подготовила
© Клычкова Олеся, старший лаборант ЦКП «Группа Геномных Технологий».
03.06.2026